成年大鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定

目的建立成年大鼠嗅球神经干细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源。方法用无血清方法分离培养成年大鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法检测BrdU、神经干细胞标记物Nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuj1、GFAP、NG2的表达。结果从成年大鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖的神经球,构成神经球的细胞呈Nestin和SOX2阳性,它们分化后产生Tuj1阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞。结论成年大鼠嗅球存在神经干细胞,能够在体外进行培养、增殖、分化,是神经干细胞的新的种子来源。     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

人胚神经干细胞分离培养与鉴定方法

目的:建立神经干细胞(NSCs)实验室分离、培养方法,为NSCs移植提供细胞源.方法:取4月龄(±15 天)正常孕妇水囊引产胎儿大脑纹状体区组织分离神经干细胞,培养于含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和B27的无血清培养基;同时利用单细胞克隆技术进行连续传代培养;利用形态学观察和免疫荧光技术检测神经上皮干细胞蛋白Nestin抗原的表达来鉴定神经干细胞.结果:体外培养的干细胞在bFGF和B27培养基中可不断增殖形成细胞球,并出现少量细胞分化.单细胞培养4天即开始分裂,同时伴有个别细胞分化;出现大量神经球一般为15天;分化的细胞在30天开始分解,50天左右基本消失.细胞培养3个月(每月补液1次)仍具有分裂增殖能力.单细胞克隆可连续传代10次,仍具增殖分化能力.液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力.单细胞克隆传代增殖的细胞球经Nestin免疫荧光鉴定,呈阳性结果,证实其胚胎源性.结论:采用bFGF和B27的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖,并有少量分化,细胞体外培养3个月、克隆连续传代10次情况下的细胞仍具有神经干细胞特性.     

不同细胞因子体外诱导神经干细胞向神经细胞分化的研究

目的观察碱性纤维母细胞生长因子、白血病抑制因子、脑源性神经营养因子及不同组合对成年SD大鼠脑神经干细胞在体外分化为神经细胞的作用。方法用含碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年SD大鼠脑神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养：bFGF、LIF、BDNF、bFGF＋LIF、bFGF＋BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin;与bFGF组、LIF组、BDNF组相比,bFGF＋BDNF组和bFGF＋LIF组神经干细胞分化为神经细胞的比例较高（P〈0．01）,其中bFGF＋BDNF组神经细胞的比例最高。结论在bFGF培养条件下,BDNF促进成年SD大鼠脑神经干细胞向神经细胞分化的能力高于LIF。     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

人胚神经干细胞分离培养与鉴定方法

目的 :建立神经干细胞 (NSCs)实验室分离、培养方法 ,为NSCs移植提供细胞源。方法 :取 4月龄 (± 15天 )正常孕妇水囊引产胎儿大脑纹状体区组织分离神经干细胞 ,培养于含碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和B2 7的无血清培养基 ;同时利用单细胞克隆技术进行连续传代培养 ;利用形态学观察和免疫荧光技术检测神经上皮干细胞蛋白Nestin抗原的表达来鉴定神经干细胞。结果 :体外培养的干细胞在bFGF和B2 7培养基中可不断增殖形成细胞球 ,并出现少量细胞分化。单细胞培养 4天即开始分裂 ,同时伴有个别细胞分化 ;出现大量神经球一般为 15天 ;分化的细胞在 3 0天开始分解 ,5 0天左右基本消失。细胞培养 3个月 (每月补液 1次 )仍具有分裂增殖能力。单细胞克隆可连续传代 10次 ,仍具增殖分化能力。液氮冻存 6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。单细胞克隆传代增殖的细胞球经Nestin免疫荧光鉴定 ,呈阳性结果 ,证实其胚胎源性。结论 :采用bFGF和B2 7的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖 ,并有少量分化 ,细胞体外培养 3个月、克隆连续传代 10次情况下的细胞仍具有神经干细胞特性     

转基因脑肿瘤小鼠模型中成体神经干细胞与脑肿瘤干细胞的克隆与鉴定

目的 从Tet-on转基因脑肿瘤小鼠模犁中分离鉴定成体神经干细胞和脑肿瘤干细胞.方法 分别从转基因小鼠肿瘤和室管膜下区取材,将细胞培养于含生长因子的无或含血清培养基.光镜下观察病理,相差显微镜和电镜下分别观察细胞形态及超微结构,流式细胞术榆测Hoechst33342阴性的SP细胞、染色体倍体和细胞周期,免疫荧光染色检测细胞球体及分化细胞表面标志物.结果 无血清培养条件下,肿瘤细胞和室管膜下区细胞均呈悬浮球状生长,含血清培养条件下贴壁分化.成体神经干细胞球细胞较小,形态相对较规则.电镜下两者均表现核质比高、细胞器不发达、具干细胞特征,但存细胞器发育上有所差异.肿瘤细胞球中异倍体细胞为26.77%.而神经球中细胞均为二倍体.免疫荧光染色两种细胞球中大部分细胞表达干细胞标志物Nestin,少数细胞表达分化标志物GFAP和NSE.贴壁后两者的大部分细胞表达分化标志物,且部分细胞共表达前体细胞标志.结论 Tet-on转基因脑肿瘤小鼠中存在具有自我更新和多向分化潜能的脑肿瘤干细胞和神经干细胞.     

中药诱导间充质干细胞向神经细胞分化后的免疫调控作用

目的:探讨多种中药成分体外定向诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并研究分化细胞的免疫调控能力.方法:通过贴壁法分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外扩增培养.多种中药成分定向诱导分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(CFAP)的表达.通过单向混合淋巴细胞反应(MLR),观察神经细胞分化的hMSCs对人外周血T淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBL)免疫调控作用.结果:hMSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪,天麻,人参诱导1～3小时后大部分hMSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性.混合培养结果显示分化hMSCs抑制hPBLs增殖反应.结论:多种中药成分和中药制剂可在体外诱导hMSCs分化为神经元样细胞,分化hMSCs抑制人淋巴细胞增殖反应,具有免疫词控作用.     

胶质瘤中脑肿瘤干细胞的分离、培养和鉴定

目的 分离、培养和鉴定胶质瘤中脑肿瘤干细胞(BTSC),探讨CD133作为BTSC特异性标记,用于BTSC分离的可行性.方法 9例胶质瘤临床标本,胶质瘤C6和U87细胞系,用直接培养和磁珠选择CD133+ 细胞二种方法分离BTSC.参照NSC培养条件,进行体外培养.观察细胞生长情况,利用免疫荧光染色检测细胞标记,包括Ncstin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等;诱导细胞分化,验证该种细胞是否具有干细胞特性.结果 9例临床标本要中,有2例儿童恶性胶质瘤在培养过程中出现神经球,在成人胶质瘤中均未出现.C6和U87细胞中,均出现比较典型的神经球,二种分离方法结果相同.神经球细胞具有增殖能力,体外培养可以不断增大.标记检测显示这种细胞Nestin阳性,而NSE和GFAP阴性.经诱导后,可以分化为肜态与来源细胞相似的细胞,能够表达NSE和GFAP等多种表型细胞标记.结论 在胶质瘤中,存在具有NSC特性的干细胞,即BTSC,CD133是BTSC重要的表面标记,可以用于BTSC的分离.在胶质瘤细胞系中CD1331 细胞是BTSC.     

去分化肌肉干细胞神经分化潜能的探讨

目的探讨去分化肌肉干细胞经条件培养诱导,具有神经干细胞性质并分化为终末神经细胞的潜能。方法依次用神经干细胞增殖及神经细胞分化条件培养基,对去分化肌肉干细胞进行体外诱导,促使其向神经干细胞转变以及向终末神经细胞分化,并通过形态学、免疫细胞化学、RT-PCR等实验手段研究其性质并加以鉴定。结果 (1)去分化肌肉干细胞在神经干细胞增殖条件培养基诱导下,可形成神经球,EdU标记阳性,抗Nestin、Neurofilament-m(NFm)、GFAP、CNPase阳性;Myogenin表达水平下调,而Nestin、Sca-1表达上调;(2)经神经细胞分化条件培养基诱导,神经球细胞可分化为形态学上典型的、抗NFm阳性神经元,以及抗GFAP、CNPase阳性神经胶质细胞。结论去分化肌肉干细胞具有神经系的多分化潜能。     

丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨丹参注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h,采用含丹参注射液的无血清L-DMEM培养液诱导MSCs,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,免疫荧光细胞化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:体外培养的大鼠MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166。丹参注射液诱导后MSCs胞体收缩,突起伸出,较密的部分神经元拉成网状,免疫细胞化学显示巢蛋白、NSE、NF-M表达阳性,阳性率分别为(58.68±4.50)%、(61.23±5.72)%、(63.47±6.38)%,GFAP阳性细胞率(1.47±0.23)%。结论:丹参注射液在体外可以将大鼠MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

CD117、Nestin、CD133和Ki67在卵巢上皮性癌组织中的表达及意义

目的研究CD117、Nestin、CD133和Ki67在卵巢上皮性癌（EOC）中的表达,探讨其表达与卵巢癌临床病理参数及预后的相关性。方法选择河北省邯郸市中心医院病理存档的石蜡标本80例,其中20例正常卵巢和60例卵巢上皮癌,采用免疫组化法（sP法）检测CD117、Nestin、CD133和Ki67的表达情况。结果CD117、Nestin、CD133和Ki67在卵巢上皮性癌中的阳性表达率明显高于在正常卵巢组织（P＜0．05）。CD117、Nestin及CD133在EOC组中的表达水平与其FIGO分期及病理分级有关,在Ⅲ一Ⅳ期、高级别组（G3）比Ⅰ-Ⅱ期、低级别组（G1、G2）表达率高（P＜0．05）。Ki67表达与卵巢癌组织分化程度、CA125水平相关差异有统计学意义（P〈0．05）。通过Kaplan-Meier生存曲线了解CD117、Nestin、CD133在预测卵巢癌预后中的价值。结论CD117、Nestin、CD133和Ki67的阳性表达在卵,巢上皮癌的发生、发展中发挥重要,CD117、Nestin、CD133可能作为卵巢癌干细胞标志物用于判断卵巢上皮性癌的预后。     

人脐带问充质干细胞体外培养、鉴定及其诱导分化的研究

目的通过体外分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs）,探讨其多向分化潜能。方法取正常足月新生儿脐带,采用组织贴壁培养法分离原代hUCMSCs,观察细胞生长形态。采用流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导,鉴定hUCMSCs的多向诱导分化能力。结果成功分离和培养hUCMSCs原代细胞,经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44和CDl05,阳性率为96．73％和96．10％,整合素受体CD29阳性率为99．53％;低表达造血系标志CD34和CD45阳性率为0．80％和1．91％,人白细胞抗原HLA-DR阳性率为1．41％。细胞周期检测hUCMSCs主要处于G0／G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导,出现神经元样细胞;免疫组化检测神经巢蛋白（Nestin）呈阳性表达。hUCMSCs成脂肪细胞诱导,出现空泡样脂肪滴,油红O染色可见脂质沉积。结论hUCMSCs具有多向分化潜能,可跨胚层诱导分化为多种组织类型的细胞。     

Eckol suppresses maintenance of stemness and malignancies in glioma stem-like cells

A subpopulation of cancer cells with stem cell properties is responsible for tumor maintenance and progression, and may contribute to resistance to anticancer treatments. Thus, compounds that target cancer stem-like cells could be usefully applied to destroy cancer. In this study, we investigated the effect of Eckol, a phlorotannin compound, on stemness and malignancies in glioma stem-like cells.To determine whether Eckol targets glioma stem-like cells, we examined whether Eckol treatment could change the expression levels of glioma stem-like cell markers and self-renewal-related proteins as well as the sphere forming ability, and the sensitivity to anticancer treatments. Alterations in the malignant properties of sphere-derived cells by Eckol were also investigated by soft-agar colony forming assay, by xenograft assay in nude mice, and by cell invasion assay.Treatment of sphere-forming glioma cells with Eckol effectively decreased the sphere formation as well as the CD133⁺ cell population. Eckol treatment suppressed expression of the glioma stem-like cell markers and the self-renewal-related proteins without cell death. Moreover, treatment of glioma stem-like cells with Eckol significantly attenuated anchorage-independent growth on soft agar and tumor formation in xenograft mice. Importantly, Eckol treatment effectively reduced the resistance of glioma stem-like cells to ionizing radiation and temozolomide. Treatment of glioma stem-like cells with Eckol markedly blocked both phosphoinositide 3-kinase-Akt and Ras-Raf-1-Erk signaling pathways.These results indicate that the natural phlorotannin Eckol suppresses stemness and malignancies in glioma stem-like cells, and thereby makes glioma stem-like cells more sensitive to anticancer treatments, providing novel therapeutic strategies targeting specifically cancer stem-like cells.     

体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为平滑肌细胞的实验研究

目的体外培养成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs),并应用血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导ADMSCs分化为平滑肌细胞。方法采用酶消化法和贴壁培养法分离培养ADMSCs,流式细胞仪对第5代细胞进行表面抗原和细胞周期的检测,然后对第5代细胞进行PDGF-BB诱导,于诱导后2周进行免疫组织化学鉴定。结果体外培养的ADMSCs呈梭形,细胞形态均一,传代稳定。干细胞相关标志CD29,CD44表达阳性,内皮细胞相关标志CD31和造血干细胞相关标志CD34表达阴性。ADMSCs中G0/G1,S,G2/M期的细胞分别占90.14%,3.77%,6.09%。定向诱导后倒置显微镜下观察细胞呈长梭状,胞膜清晰,无空泡,可重叠生长,融合后细胞形成"峰"和"谷"状,免疫荧光化学显示诱导组细胞α平滑肌肌动蛋白表达阳性。结论成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可经PDGF-BB诱导分化为平滑肌细胞。     

虾青素抑制NF-κB的激活减轻大鼠心肌梗死后的交感神经重构的研究

目的探讨虾青素对心肌梗死后的交感神经重构的影响以及可能的作用机制。方法心肌梗死组和虾青素组大鼠结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型;假手术组开胸后剪开心包腔,不结扎冠状动脉。虾青素组按100 mg/(kg·d)的剂量于术前1日开始灌胃,1次·d-1;心肌梗死对照组和假手术组灌胃等量无菌蒸馏水。28 d后用HE染色观察细胞形态,采用蛋白免疫印迹法检测心肌梗死周边NF-κB核移位、p-CX43蛋白的表达。采用免疫组化方法检测心肌梗死周边神经生长因子(NGF)、生长相关蛋白43(GAP43)、酪氨酸羟化酶(TH)的分布。结果与心肌梗死组相比,虾青素抑制了NF-κB核移位,p-CX43蛋白水平表达增多,虾青素组GAP-43与TH阳性的密度及NGF的含量明显减少。结论虾青素可减轻心肌梗死周边的交感神经重构,可能是通过抑制NF-κB的激活。     

TNF—α和IFN-α对人外周血树突状细胞功能活性的影响比较

目的研究不同细胞因子诱导的人外周血树突状细胞（dendritic cells,DC）其功能活性的不同。方法常规分离健康人外周血单核细胞,分别采用GM-CSWIL-4／TNFα、GM—CSWIL-4／细胞因子组合将其诱导为DC,用ELISA法检测各组细胞培养至第9天时其上清液中IL．12含量;用流式细胞仪检测第9天时细胞表面HLA—DR、CD1α、CD80、CD83的表达;采用MTT法检测各组刺激自体淋巴细胞增殖能力。结果第9天显微镜下观察各组细胞,IFN—α组DC细胞形态均一,有明显突起,FACM显示IFN—α组DC其膜表面标志CD1α、CD80、CD83表达上调,在刺激同种T细胞增殖能力方面,较TNF-α组DC效果明显。且IL-12分泌明显增加。结论与TNFα相比,IFN仪能在一定程度上增强其诱导的DC功能。     

人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞联合培养的实验研究

目的:探讨体外分层共培养条件下大鼠激活态雪旺细胞对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生长及分化的影响。方法:分离、培养人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞,通过Millicell小室实现两者体外共培养,根据共培养与否分为共培养组与对照组,通过巢蛋白(Nestin)、神经丝蛋白200(NF200)免疫荧光染色分析干细胞分化情况。结果:共培养组两种细胞在Millicell小室分层共培养条件下,hUCMSCs逐渐出现类似神经细胞的形态,对照组形态无明显变化。共培养组中hUCMSCs表达神经干细胞标志物Nestin,共培养1d后逐渐降低,而对照组仅低表达Nestin,共培养8h~7d,两组间差异有统计学意义(P<0.01);共培养组细胞共培养1d后hUCMSCs表达神经元标志物NF200,而对照组始终不表达NF200。结论:人脐带间充质干细胞有向神经细胞分化的能力,分层培养条件下大鼠激活态雪旺细胞可促进其神经方向分化。     

曲古抑菌素对小细胞肺癌细胞系NCI-H446的诱导分化及凋亡作用

目的探讨曲古抑菌素对NCI-H446细胞的诱导分化及凋亡的作用机制。方法用巢蛋白、CD133、波形蛋白和CD44的抗体对NCI-H446细胞进行免疫荧光染色,鉴定该细胞的干细胞特性;用NF-200、βⅢ-Tubulin、微管相关蛋白(MAP2)和BM88、Ki67的抗体进行免疫荧光染色和免疫印迹测定,观察NCI-H446细胞经曲古抑菌素诱导后向神经细胞分化的成熟程度和细胞增殖指数的变化;用Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平的变化,评价曲古抑菌素对小细胞肺癌的抗癌效果。结果小细胞肺癌NCI-H446细胞高表达巢蛋白、CD133、波形蛋白和CD44;曲古抑菌素诱导NCI-H446细胞向神经细胞分化并激活Caspase-3,诱导细胞的Bax表达水平增高,Bcl-2表达水平降低,细胞的增殖指数明显降低,凋亡指数明显增高。结论曲古抑菌素可诱导小细胞肺癌NCI-H446细胞分化成熟,最终激活Caspase-3通路导致细胞凋亡。