蛋白C基因C64W和F139V突变致蛋白C缺陷的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因C64W、F139V和K150缺失突变（K150d）致PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和突变体表达质粒（PCwt、PC C64W、PC F139V、PC K150d）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞，进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色；用荧光实时PCR（real-time PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变；蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径；内糖苷酶-H（Endo H）酶切试验检测PC翻译后侧链糖化修饰。结果PC C64W未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解，PC F139V仅部分从细胞内分泌，大部分未分泌并在细胞内逐渐降解，PC K150d突变体蛋白的分泌未受突变的明显影响。real-time PCR结果显示，与野生型PC mRNA相比，突变体PC mRNA不降低；蛋白降解抑制实验显示，PC C64W和PC F139V通过蛋白酶体途径进行细胞内降解。Endo H酶切和转染细胞荧光染色显示，PC C64W和PC F139V主要位于前高尔基体。结论分泌障碍和细胞内降解是PC C64W和PC F139V导致PC缺陷症的原因，PC K150d对突变体蛋白的分泌无明显影响。     

兔骨髓间充质干细胞经Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染定向分化为软骨细胞

目的:通过软骨组织工程与基因治疗相结合的技术,利用腺病毒载体将转化生长因子β1基因导入兔骨髓间充质干细胞,使其诱导靶细胞定向分化为软骨细胞。方法:实验于2004-03/2006-03在徐州医学院完成。①实验方法:兔麻醉后自胫骨上端抽取骨髓,体外分离培养骨髓间充质干细胞。取第2代细胞,以1×104/cm2接种,达70%融合时分为3组:Ad-TGFβ1转染组采用H-DMEM无血清培养基,加入刚解冻的Ad-TGFβ1液30μL,地塞米松100nmol/L,维生素C50mg/L;Ad-GFP对照组采用H-DMEM无血清培养基,加入Ad-GFP腺病毒,地塞米松100nmol/L,维生素C50mg/L;空白对照组采用H-DMEM完全培养基,不外加任何试剂或药品。②实验评估:倒置显微镜逐日观察细胞生长情况。分别于转染后7,14,21,28d检测细胞内蛋白多糖、转化生长因子β1、Ⅱ型胶原的表达。结果:①细胞形态学观察:Ad-TGFβ1转染后7d,集落中的细胞呈放射状向周围扩展,均一性好,呈长梭形,紧密排列似漩涡状,生长速度明显增快,细胞密度明显增高。②转染后细胞内蛋白多糖的检测:Ad-TGFβ1转染后14d胞浆呈紫蓝色,异染性明显,胞核清晰,可见核仁。转染后28d细胞明显老化,但胞浆中仍可见紫蓝色异染。其余两组均未见明显的异染性。③转染后转化生长因子β1的表达:Ad-TGFβ1转染组细胞中转化生长因子β1呈强阳性表达,其余两组几乎检测不到转化生长因子β1的表达。④转染后细胞内Ⅱ型胶原的表达:Ad-TGFβ1转染后7d胞浆中Ⅱ型胶原呈弱阳性表达,转染后14,21d呈强阳性表达,转染后28d表达有所降低。其余两组几乎不表达Ⅱ型胶原。结论:经Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染,兔骨髓间充质干细胞可定向分化为软骨细胞,是获得软骨组织工程种子细胞的方法之一。     

野生型和突变型肝豆状核变性蛋白对皮肤成纤维细胞内过多铜的转运作用

目的:将野生型和突变型(R778L)肝豆状核变性基因(ATP7B)转染入Me32aT22/2L细胞株中进行表达,观察野生型和突变型ATP7B的铜转运功能,为以后更深入的基因治疗奠定基础。方法:采用脂质体转染法分别将含野生型和突变型cDNA重组真核表达载体pRc/CMV-WD转染到Me32aT22/2L细胞株中,免疫荧光观察野生型和突变型ATP7B在细胞内的分布,以及铜孵育实验检查野生型和突变型ATP7B的铜转运功能。结果:在转染的Me32aT22/2L细胞株中可检测到ATP7B的表达,ATP7B位于细胞核的周围,在24和48小时后,细胞内铜/蛋白比值分别为335.33±49.86和477.38±30.95,而突变型ATP7B组铜/蛋白比值分别为606.14±45.72和901.84±53.18,两者比较具有统计学差异(P<0.05)。结论:野生型ATP7B具有铜转运功能,而突变型ATP7B则丧失了铜转运的功能。突变R778L基因是肝豆状核变性的致病基因。     

原钙黏蛋白7对小鼠皮层神经元细胞凋亡的影响

目的探讨原钙黏蛋白7(protocadherin 7, Pcdh7)基因在促进小鼠皮层神经元细胞凋亡中的作用及可能机制。方法原代培养的C57BL/6小鼠皮层神经元细胞,随机分为空载组(转染空白质粒)、Pcdh7过表达组(转染Pcdh7过表达质粒)、Ca~(2+)通道阻滞组(转染Pcdh7过表达质粒及Ca~(2+)通道抑制剂西尼地平)。转染48 h,采用流式细胞仪检测3组神经元细胞内Ca~(2+)荧光强度,CCK-8法检测3组神经元细胞存活率,荧光探针法检测3组神经元细胞凋亡率。结果 Pcdh7过表达组神经元细胞内Ca~(2+)荧光强度[(30.57±4.34)MFI]高于空载组[(18.60±0.57)MFI]和Ca~(2+)通道阻滞组[(18.63±1.97)MFI](P0.05),空载组与Ca~(2+)通道阻滞组比较差异无统计学意义(P0.05);Pcdh7过表达组神经元细胞存活率吸光度值(0.64±0.04)低于空载组(1.01±0.03)和Ca~(2+)通道阻滞组(0.84±0.02)(P0.05),且Ca~(2+)通道阻滞组低于空载组(P0.05);Pcdh7过表达组神经元细胞凋亡率[(34.10±4.00)%]高于空载组[(13.56±2.48)%]和Ca~(2+)通道阻滞组[(13.98±3.00)%](P0.05),空载组与Ca~(2+)通道阻滞组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论过表达Pcdh7基因可诱导小鼠皮层神经元细胞凋亡,其机制可能与促进细胞内Ca~(2+)内流有关。     

短发夹核糖核酸沉默EZH2基因对人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨短发夹核糖核酸（sh RNA）对高表达EZH2的人胶质瘤细胞株U251增殖和侵袭的影响。方法构建针对EZH2的sh RNA重组质粒,采用电穿孔的方法转染至U251细胞中,分为对照组、control-sh RNAGFP空载体转染组和EZH2-sh RNA重组质粒转染组。分别通过逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测各组细胞EZH2基因和蛋白的表达,以噻唑蓝法测各组细胞的增殖活性,蛋白质印迹法检测各组细胞的EZH2蛋白表达水平;Transwell小室检测细胞侵袭力。结果对照组、control-sh RNA-GFP空载体转染组、EZH2-sh RNA重组质粒转染组U251细胞EZH2基因的表达分别为1.13±0.05、1.15±0.05、0.19±0.02,U251细胞EZH2蛋白的表达分别为1.03±0.03、0.97±0.06、0.20±0.02,转染后24 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.31%、100.03%±9.35%、60.13%±3.15%,转染后48 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.13%、99.58%±9.27%、53.01%±3.14%,重组质粒转染组较另两组均明显下降,差异有统计学意义（P〈0.05）;重组质粒转染组转染48 h后细胞磷酸化蛋白激酶B和磷酸化叉头框蛋白O1水平降低、细胞周期蛋白D1表达减少、p27蛋白表达增多,差异有统计学意义（P〈0.05）。Transwell小室侵袭实验显示侵袭至Transwell小室滤膜下表面的细胞数在EZH2-sh RNA重组质粒转染组[（46.00±2.82）个]低于对照组[（60.67±5.71）个]和control-sh RNA-GFP空载体转染组[（61.00±2.48）个],差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 EZH2基因沉默能有效抑制人胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,为深入研究EZH2在胶质瘤中作用提供了研究基础。     

解偶联蛋白2表达对颗粒细胞抗氧化应激的影响

目的：通过观察体外培养颗粒细胞解偶联蛋白2（UCP2）表达变化对细胞抗氧化能力的影响，探讨颗粒细胞参与卵泡抗氧化应激的机制.方法：体外培养人颗粒细胞，分别加入过氧化氢（0.25 mmol/L），ATP（1 mmol/L），ATP＋过氧化氢，继续培养24 h，检测颗粒细胞凋亡发生率.结果：过氧化氢可以诱导颗粒细胞UCP2表达，应用ATP抑制UCP2表达后，细胞凋亡发生率增加，细胞抗氧化能力下降.结论：UCP2通过负反馈机制控制细胞内活性氧水平，参与颗粒细胞抗凋亡和对卵母细胞氧化应激保护作用.     

低浓度紫杉醇通过上调Bim表达诱导HepG2细胞凋亡

目的探讨低浓度紫杉醇诱导肝癌细胞HepG2凋亡的机制。方法采用MTT还原法检测细胞增殖;采用流式细胞术分析细胞凋亡与细胞周期;采用免疫印迹技术检测细胞内Bim等凋亡相关信号分子的表达。结果紫杉醇对HepG2细胞90%的抑制浓度为9.50nmol/L;3,6和12nmol/L的PTX分别可诱导6.1±2.3%,17.2±4.1%和6.9±2.9%发生凋亡。3-12nmol/L紫杉醇对Bcl-2和Bax表达无影响,但细胞内促凋亡分子Bim表达增加,同时促进Bim降解的Erk1/2磷酸化(活化相关位点)下降。结论低浓度紫杉醇通过上调Bim表达诱导HepG2细胞凋亡。     

GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响及作用机制探讨

目的　通过检测G蛋白偶联受体家族C群5成员A（G protein coupled receptor C type group 5 member A, GPRC5A）在肝癌组织及细胞中的表达,探讨GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡、氧化应激的影响及其相关作用机制。方法　收集2018年12月～2019年11月在解放军联勤保障部队第九六九医院行手术治疗的38例肝癌患者癌组织及配对癌旁正常组织样本;另选取人正常肝上皮细胞株HL-7702和人肝癌细胞株（HepG2,HCCLM3,HuH-7和MHCC-97H）进行研究。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肝癌组织、癌旁正常组织及肝癌细胞、正常肝上皮细胞中GPRC5A表达量。通过转染pcDNA3.1-GPRC5A质粒构建过表达GPRC5A肝癌细胞株,采用MTT实验和V-FITC/PI凋亡试剂盒分别检测过表达GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。采用活性氧指示剂DCFH-DA检测细胞中氧化应激相关因子活性氧（ROS）,NAD+/NADH和三磷酸腺苷（ATP）水平。采用Western blot实验检测凋亡相关蛋白caspase-3及上皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平。结果　肝癌组织中GPRC5A表达较癌旁正常组织显著降低（0.34±0.09 vs 0.73±0.10）,差异有统计学意义（t=17.869,P<0.01）。肝癌细胞HepG2（0.35±0.06）,HCCLM3（0.38±0.10）,HuH-7（0.53±0.07）,MHCC-97H（0.67±0.06）中GPRC5A表达量显著低于人正常肝上皮细胞HL-7702中的GPRC5A表达量（1.00±0.08）,差异有统计学意义（t=5.716~11.258, 均P<0.05）。pcDNA3.1-GPRC5A组转染36 h细胞增殖吸光度（A）值（0.94±0.16）显著低于对照组（1.49±0.05）和pcDNA3.1组（1.45±0.07）（F=25.640,P<0.01）。GPRC5A过表达组VEGF（0.98±0.04）表达量较对照组（2.94±0.15）和pcDNA3.1组（2.89±0.11）显著降低（F=310.450,P<0.001）。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中ROS（182.12±13.42）水平显著高于对照组（101.23±11.20）和pcDNA3.1组（98.30±10.26）（F=49.577,P<0.001）;NAD+/NADH（35.24±6.43）及ATP（55.34±6.51）水平显著低于对照组（100.25±12.41,100.17±14.36）和pcDNA3.1组（97.86±9.67,102.23±11.02）（F=42.338,17.077,P<0.05）。GPRC5A过表达组细胞凋亡率高于对照组和pcDNA3.1组;细胞凋亡蛋白caspase-3（2.61±0.16）表达量也高于对照组（1.00±0.11）和pcDNA3.1组（1.01±0.02）（F=202.843,P<0.001）。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中p-STAT3表达量（0.43±0.06）显著低于对照组（1.00±0.13）和pcDNA3.1组（1.03±0.12）（F=29.476,P<0.001）;pcDNA3.1-GPRC5A组下游基因Socs3（0.47±0.05）,c-MYC（0.54±0.06）表达量也显著低于对照组（1.01±0.05,1.00±0.04）和pcDNA3.1组（0.98±0.09,1.02±0.06）（F=63.275,75.409,P<0.001）。肝癌组织中STAT3与GPRC5A表达量呈显著负相关（r=-0.746,P<0.01）。过转染pcDNA3.1-STAT3或pcDNA3.1-NLRP3后显著逆转了pcDNA3.1-GPRC5A对肝癌细胞的抑制作用（P<0.05）。结论　GPRC5A低表达可能通过调节STAT3/Socs3/c-MYC信号和炎症反应抑制了肝癌细胞的增殖,诱导肝癌细胞的氧化应激和凋亡。     

miR-802对叉头框转录因子M1抑制A549/DDP细胞顺铂耐药性的靶向调控作用

目的探讨miR-802抑制非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性及其对叉头框转录因子M1(forkhead box protein M1, FoxM1)的靶向调控作用。方法 A549、A549/DDP细胞采用反转录PCR法检测miR-802相对表达量。将A549/DDP细胞分为空白转染组和miR-802过表达组(过表达组),分别转染miR-NC和miR-802类似物(miR-802 mimics),转染24、48、72、96 h后,采用反转录PCR法检测2组细胞miR-802相对表达量,并采用CCK-8法检测2组细胞增殖率;转染48 h后,CCK-8法检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性,采用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率和细胞周期,采用Western blot法检测转染后A549/DDP细胞内FoxM1蛋白相对表达量。结果 A549/DDP细胞miR-802相对表达量(0.21±0.03)低于A549细胞(0.85±0.12)(P<0.05);转染24、48、72、96 h,过表达组细胞miR-802相对表达量依次增高(P<0.05),且均高于空白转染组(P<0.05);转染48、72、96 h,空白转染组细胞增殖率依次增高(P<0.05),且均高于过表达组(P<0.05);转染48 h,过表达组细胞半数抑制浓度[(35.28±2.17)mg/L]和细胞早期凋亡率[(17.2±1.1)%]均高于空白转染组[(14.22±1.28)mg/L、(9.0±0.8)%](P<0.05),S期和G2/M期细胞比率[(21.30±0.20)%、(8.35±0.33)%]及细胞内FoxM1蛋白相对表达量(0.21±0.04)均低于空白转染组[(27.54±0.52)%、(14.67±0.70)%、0.44±0.06](P<0.05)。结论 miR-802可能通过抑制FoxM1表达而降低非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性。     

MicroRNA-205通过甲基化修饰调节帕金森病多巴胺神经元LRRK2表达

目的 探讨MicroRNA-205(miR-205)如何调节LRRK2表达从而在帕金森病中发挥作用。方法 诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）成为PD细胞模型,检测PD细胞模型中miR-205以及LRRK2的表达量;转染前体miR-205,使miR-205过表达,随后q-PCR方法检测miR-205过表达PD模型细胞中LRRK2转录水平变化;转染miR-205抑制剂,随后q-PCR方法检测miR-205抑制PD模型细胞中LRRK2转录水平变化。结果 相较于正常细胞（1.02±0.14）,PD模型细胞中miR-205的表达水平明显降低（0.59±0.03）,差异有统计学意义（P=0.017）;而相较于正常细胞（1.00±0.11）,PD模型细胞中LRRK2水平上调（1.50±0.10）,差异有统计学意义（P=0.033）;相较于正常细胞（1.02±0.11）以及PD模型细胞（1.47±0.12）,使用前体miR-205处理SH-SY5Y细胞可持续抑制LRRK2蛋白表达约50%(0.87±0.11),差异有统计学意义（P=0.020）;相较于正常细胞（1.02±0.11）以及PD模型细...     

不同百草枯中毒剂量对兔肺损伤程度的影响

目的研究不同百草枯(PQ)中毒剂量对兔中毒性急性肺损伤(ALI)及肺纤维化(PF)程度的影响。方法将36只成年新西兰大白兔随机分成3组(A、B、C组),每组12只,分别经胃管灌入8mg/kg(A组)、16mg/kg(B组)和32mg/kg(C组)不同剂量的PQ。7d后处死动物,取肺组织行HE染色、ALI评分并行Masson染色以鉴定PF程度。结果 A组ALI评分为(8.33±1.03)分,明显低于B组([9.83±1.17)分,P=0.047)]和C组([11.50±1.38)分,P0.01],B组较C组差异也有统计学意义(P=0.03);A组PF程度为(31.09±2.05)%,明显低于B组([34.37±1.62)%,P=0.002]和C组([36.54±0.44)%,P0.01],B组较C组差异也有统计学意义(P=0.026)。Pearson相关分析显示不同剂量的PQ与ALI、PF程度明显相关。结论随中毒剂量的增大,兔急性肺损伤及PF的病理改变越显著。PQ剂量与肺损伤程度及PF程度密切相关。     

干细胞转录因子Oct4及Sox2对宫颈癌细胞成瘤、迁移和浸润能力的影响

目的 探讨Oct4和Sox2对宫颈癌细胞(以下简称HeLa细胞)成瘤、迁移和浸润能力的影响.方法 复苏并培养HeLa细胞,分别构建Oct4及Sox2过表达质粒及空载质粒,采用脂质体方法转染至HeLa细胞,按转染质粒的不同分为4组(正常对照组、Oct4过表达组、Sox2过表达组和过表达空载组),铺至6孔板中,每组一个孔(...     

黄芪甲甙对Balb/C小鼠CVB3病毒性心肌炎心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax基因和蛋白表达的影响

[目的]探讨黄芪甲甙对Balb/C小鼠CVB3病毒性心肌炎心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax基因与蛋白表达的影响.[方法]Balb/C小鼠50只随机分5组（每组10只）,A组空白对照组：腹腔无菌注射不含病毒的Eagle＇s培养基0.1 mL,30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7 d;B组病毒性心肌炎对照组：小鼠每只腹腔注射0.1 mL内含50%组织感染率（TCID50） 为1×10^5的CVB3病毒Eagle＇s培养基,30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7 d;黄芪甲甙低、中、高剂量干预组（分别为C、D、E组）,在腹腔注射0.1 mL内含TCID50 为1×10^5的CVB3病毒Eagle＇s培养基,30 min后,用黄芪甲甙[具体剂量分别为0.07、0.2、0.6 mg/（kg·d）]0.1 mL灌胃,共7 d.采用缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌凋亡细胞,免疫组织化学检测Bcl-2、Bax蛋白的表达,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bcl-2、Bax基因的表达,并利用图像分析系统测量平均光密度值进行半定量分析.[结果]与A组比较,B组心肌细胞凋亡发生率增高（0.57±0.16vs 0.06±0.02,P〈0.01）;抑制凋亡因子Bcl-2基因（0.52±0.12 vs 0.76±0.11,P〈0.01）及蛋白（6.08±1.15 vs 12.38±3.05, P 〈0.01）表达下降,而促进凋亡因子Bax基因（0.79±0.12 vs 0.61±0.14, P 〈0.01）及蛋白（6.21±1.52 vs 3.01±0.75, P 〈0.01）表达增强,Bcl-2/Bax mRNA比值降低（0.58±0.14vs0.87±0.12,P〈0.05）.与B组比较,E组CVB3病毒性心肌炎心肌细胞的凋亡指数（0.09±0.03vs 0.57±0.16,P〈0.05）降低,Bcl-2基因（0.74±0.12 vs 0.52±0.12,P〈0.05）及蛋白水平（11.82±2.96 vs 6.08±1.15, P 〈0.05）表达增强,Bax基因（0.63±0.13 vs 0.79±0.12,P〈0.05）及蛋白（3.15±0.72 vs 6.21±1.52,P〈0.05）水平表达下降.[结论]黄芪甲甙在Balb/C小鼠CVB3病毒性心肌炎中抗凋亡作用机制可能是促进抑制凋亡基因Bcl-2表达,而抑制促凋亡Bax基因表达.     

阻断CD40／CD40L通道诱导同种胰岛移植免疫耐受的研究

目的：观察阻断CD40／CD40L共刺激通路对同种胰岛移植免疫反应的影响,探讨CD40L单克隆抗体对诱导同种移植免疫耐受的作用。方法：清洁级Wistar大鼠,STZ 60mg／kg诱导1型糖尿病模型,随机分为三组,A组：糖尿病大鼠,B组：糖尿病大鼠＋胰岛细胞＋抗CD40L抗体,C组：糖尿病大鼠＋胰岛细胞。B组在移植前24h注入抗CD40L抗体每只20μg。同种胰岛细胞来自SD大鼠,胶原酶V消化法和Ficoll400密度梯度离心法分离纯化胰岛细胞,收获量为（3．49±0．23）×10^5 IEQ／kg,将同种胰岛细胞按12000IEQ／kg导入受体,移植后每天和每周相同时间点检测血糖和体重变化,3d、7d、15d、22d后检测白介素-2的表达。结果：同种异体胰岛移植可使1型糖尿病大鼠的血糖降至正常并维持一段时间,A组为（23．84±2．74）mmol／L,B组（8．15±1．40）mmol／L,维持（18．12±4．12）d,C组（7．42±2．55）mmol／L,维持（8．00±1．30）d,后两组正常血糖维持天数比较,P〈0．001,有统计学意义。体重变化比较：非移植的A组随着时间的延长,体重不断下降,B、C组至移植后体重有所回升,但移植4周后C组的体重再次下降。移植7d、15d后,IL-2的表达B组和C组比较有显著性差异,B组为（0．1280±0．0104）和（0．1235±0．0073）,C组为（0．1744±0．0096）和（0．1667±0．0098）（P〈0．001）,移植22d后两组比较差异无显著性。结论：CD40L单克隆抗体阻断CD40／CD40L共刺激通路显著延长移植的同种胰岛细胞的存活时间,诱导机体产生针对胰岛移植物的免疫耐受状态。     

胰高糖素样肽1在血管再生中的作用及其机制研究

目的：探讨胰高糖素样肽1（GLP-1）对高糖培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其可能机制。方法人脐静脉内皮细胞分组培养,正常葡萄糖组（NG,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）,高葡萄糖组（HG,葡萄糖浓度33 mmol/L）,高糖加GLP-1干预组（分为低剂量组,中剂量和高剂量组,浓度分别为1、10、20 nmol/L,分别记为C1、C2、C3组）,于培养24 h,48 h和72 h用MTT法检测细胞增殖情况,并用ELISA法检测培养基上清液中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的浓度。结果48 h后高糖组细胞增殖明显低于正常对照组,GLP-1干预后能明显促进细胞增殖,以中剂量最为明显（0.6±0.11 vs.0.47±0.09,P＜0.05）,72 h这种情况更为明显;高糖培养48 h细胞分泌VEGF明显减少[（101.72±6.82） ng/ml vs.（184.66±14.06 ng/ml）,P＜0.05],GLP-1干预后VEGF水平明显增加（P＜0.05）,尤其是中剂量组,72 h结果相似。结论 GLP-1能促进细胞分泌VEGF从而改善高糖导致的内皮细胞增殖能力下降。     

沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病KG-1细胞凋亡的影响

摘要本研究旨在探讨沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病细胞株KG-1增殖和凋亡的影响。将SUV39HIsiRNA经Lipofectamine…2000转染至KG-1细胞,应用MTS法检测细胞增殖率,观察sUV39111siRNA对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞凋亡;Westernblot检测SUV39H1siRNA作用后P15和凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达。结果表明,沉默SUV39H1基因可抑制细胞增殖,SUV39H1siRNA浓度为30、60、120、240nmol／L作用48h后,KG-1细胞的增殖率分别为（76．43±1．98）％、（51．31±1．84）％、（37．31±1．61）％、（18．94±3．22）％,差异具有统计学显著意义（P〈0．05）;SUV39HIsiRNA可上调P15基因的表达;SUV39H1siRNA可诱导细胞凋亡,30、60、120nmoL／LSUV39H1siRNA作用48h后,KG-1细胞凋亡率分别为（40．2±5．1）％、（56．8±4．8）％、（71．6±5．6）％,差异有统计学显著意义（P〈0．05）;抗凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达减少。结论：SUV39H1siRNA能抑制KG-1细胞的增殖并诱导其凋亡,有望成为白血病治疗的-个新的靶点。     

大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统。方法采用EcoRⅠ酶双酶切将目的基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定。成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度。重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察转染效率及miR-1表达水平。结果测序结果显示目的基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数（MOI）50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达。结论成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体。     

不同剂量阿托伐他汀对急性冠状动脉综合征患者血浆B型钠尿肽水平影响

目的 测定急性冠状动脉综合征( ACS)患者应用不同剂量阿托伐他汀后血浆B型钠尿肽(BNP)及超敏C反应蛋白(hsCRP)水平的变化,探讨ACS患者住院早期应用阿托伐他汀的临床意义及最佳剂量.方法 选择ACS患者78例,随机分为3组:阿托伐他汀10 mg组28例,阿托伐他汀20 mg组28例,阿托伐他汀40 mg组22例,均于入院24小时内开始给予阿托伐他汀治疗,测定3组入院时及治疗5天后血浆BNP及hsCRP水平的变化.结果 ACS患者早期应用阿托伐他汀可明显降低血浆BNP及hsCRP水平,阿托伐他汀20 mg组及阿托伐他汀40 mg组均优于阿托伐他汀10 mg组,BNP( 543±116)ng/L,(531±112) ng/L vs(738±121)ng/L( P＜0.01); hsCRP(7.02±3.17) mg/L,(6.87±3.21)mg/L vs (9.32±3.43) mg/L(P＜0.01),阿托伐他汀40 mg组优于阿托伐他汀20 mg组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ACS患者早期应用阿托伐他汀可降低血浆BNP及hsCRP水平,阿托伐他汀40 mg、20 mg作用明显优于10 mg.     

CYP2C9和VKORC1基因多态性与华法林剂量关系的研究

目的研究江苏徐州地区汉族人细胞色素P450(CYP)2C9和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)基因型与华法林剂量的关系,为华法林个体化给药方案提供建议。方法采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)技术检测100名汉族健康受试者及200例临床使用华法林的患者CYP2C9和VKORC1基因型。结果健康受试者CYP2C9基因型中91例为*1/*1型,9例为*1/*3型;VKORC1基因型中17例为GA型,83例为AA型。200例临床使用华法林的患者CYP2C9基因型检测有179例为*1/*1型,21例为*1/*3型,未发现*2突变;VKORC1(1639GA)基因型中168例为突变纯合子AA型,32例为杂合子GA型,未发现GG型;VKORC1(1639GA)基因AA型患者的华法林维持剂量为(2.59±0.83)mg/d,明显低于GA型[(4.51±0.79)mg/d];CYP2C9基因*1/1*型华法林维持剂量为(3.01±1.12)mg/d,明显高于*1/*3型[(2.19±0.32)mg/d,P0.05]。结论 CYP2C9和VKORC1基因型的多变量个体化给药方案对临床提高华法林使用的安全性有潜在的意义。     

下肢深静脉血栓患者口服华法林初始剂量探讨

目的：探讨不同年龄的下肢深静脉血栓（ deep venous thrombosis ,DVT）患者口服华法林的最佳初始剂量。方法我科2012年1月至2013年10月收治112例急性下肢深静脉血栓患者,根据患者年龄分为甲、乙、丙三组,并给予不同的初始剂量,甲组27例（＜51岁,初始剂量3.75 mg）,乙组52例（51～70岁,初始剂量2.5 mg）,丙组33例（＞70岁,初始剂量1.25 mg）。通过监测国际化标准比值（ INR）调整华法林用量,监测三组患者INR达到2.0～3.0时的时间及华法林维持剂量。结果 INR达到2.0～3.0时,甲组用时（7.2±1.2）d,华法林剂量为（4.23±0.82）mg;乙组用时（9.3±1.5）d,华法林剂量为（4.05±0.64）mg;丙组用时（9.7±0.7）d,华法林剂量为（3.32±0.45）mg。结论对于不同年龄的急性DVT患者,可选择不同的华法林初始剂量,使患者更快、更安全的达到维持剂量。