不同方法制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架的组织结构

背景:理想的脱细胞方法要求既能完全去除供体细胞,降低免疫原性,又能保留天然瓣膜的胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分,以保持足够的机械强度。目的:采用不同洗剂制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,对比其组织结构,探讨最为有效的脱细胞瓣膜支架制备方法。方法:20个新鲜猪主动脉瓣膜随机分为新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂-酶消化组,后3组分别使用TritonX-100、胰蛋白酶以及二者联合的方法制备脱细胞瓣膜支架,对比支架大体形态、苏木精-伊红染色、Mallory-Heidenhain染色和电镜下超微结构的不同。结果与结论:经脱细胞处理后,去污剂组瓣叶柔软、光滑,苏木精-伊红染色少量核物质存留、纤维排列规整,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维相交错,电镜下呈波浪状排列、原纤维横纹清楚;酶消化组瓣叶局部塌陷,苏木精伊红染色细胞完全去除、纤维排列较紊乱,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,电镜下纤维部分断裂、原纤维横纹存在;去污剂-酶消化组瓣叶柔软、光滑,苏木精伊红染色细胞完全去除、纤维完整,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维平行排列,电镜下纤维完好,但排列稀疏,原纤维横纹清晰。说明3种方法均可有效去除供体细胞,保持纤维结构相对完整,在完全清除供体细胞并保持纤维支架完整性方面,TritonX-100联合胰蛋白酶的方法更为有效。     

聚乙二醇交联去细胞瓣构建组织工程瓣膜复合支架

目的 采用分子量20 kDa 的枝化状丙烯酰化聚乙二醇(PEG)交联巯基化去细胞瓣,构建组织工程瓣膜复合支架,并对支架的结构稳定性、力学性能和细胞相容性进行初步检测.方法 取猪新鲜主动脉瓣叶,进行脱细胞瓣处理,制备去细胞瓣并巯基化.戊二醛固定去细胞瓣,PEG 交联巯基化去细胞瓣.形态学观察去细胞及交联效果,差示扫描量热法(DSC)测定热收缩温度,Ⅰ型胶原酶溶液测定其抗酶性分解能力,拉伸实验测定其抗拉强度和弹性模量,并采用AlamarBlue 法测定支架对MRC-5 人胚肺细胞的细胞毒性.结果 HE 染色和扫描电镜(SEM)显示去细胞完全,细胞外基质保存完整;PEG 交联后瓣叶变薄,纤维增粗呈束.PEG 交联瓣的热收缩温度为(75.16 ±0.69)℃,与去细胞瓣[(67.63 ±1.09)℃]相比有显著提高,其差异有统计学意义(P ＜0.05).PEG 交联瓣6 h 及12 h酶性分解率分别为(17.52 ±1.69)%和(48.83 ±2.67)%,与去细胞瓣[(64.91 ±2.05)%和(98.23 ±1.20)%]相比,分解率显著下降.PEG 交联瓣抗拉强度较去细胞瓣显著为高,并达到天然瓣水平,弹性模量则远高于其他各组.细胞毒性试验显示PEG 组和对照组活力细胞差别为(1.82 ±0.03)%,无统计学意义(P ＞0.05).结论 PEG 交联可显著改善去细胞瓣结构稳定性和力学性能,而无明显细胞毒性,有望用于组织工程瓣膜复合支架的构建.     

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜

背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活.目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用.同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成.材料:新鲜猪心脏瓣膜取白上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理.密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞.方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况.以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组.主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况.②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果.结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层.扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架.免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性.结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附.     

血管内皮细胞生长因子修饰的聚乙二醇化去细胞瓣构建心脏瓣膜复合支架

目的对去细胞瓣进行聚乙二醇(PEG)化改性和血管内皮细胞生长因子(VEGF)共价修饰,以改善去细胞瓣力学性能和生物学性能,并联合内皮祖细胞构建心脏瓣膜复合支架。方法枝化状PEG末端的丙烯酰基与引入到去细胞瓣上的巯基,通过迈克尔加成反应完成去细胞瓣的PEG化,并作去细胞瓣PEG化前后以及天然主动脉瓣的生物力学测定;通过PEG化去细胞瓣上未饱和的丙烯酰基与VEGF中半胱氨酸残基上的巯基发生另一个迈克尔加成反应,对去细胞瓣进行VEGF共价修饰,免疫荧光测定VEGF修饰效果;在VEGF修饰的PEG化去细胞瓣、去细胞瓣和PEG化去细胞瓣上种植内皮祖细胞(EPCs),培养10d后行瓣膜上DNA含量测定、苏木素-伊红染色和扫描电镜。结果力学测试显示:PEG化去细胞瓣的最大抗张强度较单纯去细胞主动脉瓣明显提高(P<0.05),而与天然主动脉瓣相比无差异(P>0.05);免疫荧光检测显示:VEGF可有效地共价修饰PEG化去细胞瓣;与PEG化去细胞瓣和单纯去细胞瓣相比,VEGF修饰的PEG化去细胞瓣明显促进EPCs的增殖,并且可在瓣膜表面形成一层连续的单细胞层。结论 PEG化可明显改善去细胞瓣的力学性能,并且VEGF修饰PEG化去细胞瓣可促进支架上黏附细胞的增殖,有利于改善组织工程心脏瓣膜的构建。     

猪去细胞心脏瓣膜的免疫原性

背景:在去细胞猪瓣膜(Synergraft 瓣膜)的临床应用时发现异种的细胞外基质引发了人体一个强烈的炎症反应.早期的炎症反应严重地削弱了瓣膜内壁的基质结构,导致了移植物的结构破坏及衰败.从Synergraft瓣膜的事件中认识到猪去细胞瓣膜仍然具有免疫原性,尤其是在儿童患者中这种免疫反应会更强烈.因此对于细胞外基质蛋白引起的免疫排斥反应仍需要进一步的研究.目的:通过生物信息学的方法找到人与猪细胞外基质蛋白的基因序列差异,并制备抗体验证基质的免疫原性.设计、时间及地点:以Ⅳ型胶原基质为观察对象进行人、猪细胞外基质基因差异性的对比研究.于2008-06/2009-05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成.材料:新鲜猪瓣膜由上海五丰上食肉联厂提供,去细胞猪瓣膜、杂交瘤细胞和单克隆抗体由长海医院胸心外科实验室制备.方法:通过比较人、猪、鼠基因序列之间的相似区域和保守性位点,寻找有进化关系基因序列之间共同的保守区域、位点和序列差异,探索导致它们产生共同功能的基因序列以及基因序列间的差异片段.应用制备的抗猪Ⅳ型胶原单克隆抗体,采用免疫组化染色鉴定猪去细胞瓣膜上的猪瓣膜自身的细胞外基质存留情况.主要观察指标:Ⅳ型胶原基因序列差异分析结果、自制抗体有效性的免疫组化测试、自制抗体对猪去细胞瓣膜Ⅳ型胶原的检测结果.结果:通过基因比对的方法找到了人与猪Ⅳ型胶原的基因序列差异.通过杂交瘤技术成功制备检测细胞外基质的单克隆抗体;用免疫组化的方法检测到猪去细胞瓣膜上有猪的细胞外基质存留.结论:猪去细胞瓣膜支架上检测到有猪的细胞外基质存留,并且具有免疫原性.     

去细胞坐骨神经天然支架的成分分析

背景：目前周围神经去细胞的方法较多,应用较多的是化学萃取法和液氮冻融法,但是化学萃取法耗时较长,而液氮冻融法则去除细胞不彻底。作者在查阅大量文献和多次实践的基础上,最终确定了冻融＋化学萃取＋机械振荡的优化法对坐骨神经进行脱细胞处理。目的：对优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架进行形态学分析,并对其成分进行鉴定。方法：取Wistar大鼠双侧坐骨神经,随机分为2组,对照组不做特殊处理,实验组用冻融＋化学萃取＋机械振荡的优化法进行脱细胞处理。结果与结论：用优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架呈三维管状立体结构,许旺细胞、髓鞘及轴突去除完全。经免疫组化鉴定,Ⅰ型、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白等细胞外基质主要成分得到保留。     

1例血小板减少患者冠状动脉支架植入术后抗血小板治疗的护理

<正>冠状动脉内支架植入术是目前冠心病血运重建的重要方法,支架植入后可显著减少靶血管的急性闭塞和再狭窄。抗凝和抗血小板治疗是PCI围手术期和术后药物治疗的基础。而血小板是参与血液凝固及血栓形成的重要因子。血小板数量缺乏、减少或功能不全常导致出血发生率的增加,在合并应用抗凝、抗血小板药物时出血发生率更加明显[1,2]。如何预防和减     

适宜单层缝合置入的无支架猪主动脉瓣膜性能评价

背景：现有的生物瓣膜主要分为有支架和无支架两种。有支架瓣膜方便了手术操作,容易植入,植入后发生关闭不全的可能性小,但这种瓣膜并没有很好的模拟天然瓣膜。目的：为缩短瓣膜植入时间,进一步改善瓣膜性能,在参考猪主动脉根构型优化瓣膜设计的基础上,开发一种新型的适合单层缝合置入的无支架猪主动脉瓣膜,体外测试评估其性能。方法：①制备适合单层缝合的无支架猪主动脉瓣。②采用自行设计的新型单层缝合方法进行离体瓣膜植入实验。③对新型瓣膜进行体外流体力学测试及疲劳测试。结果与结论：适合单层缝合的无支架瓣膜在设计中去除了硬质的瓣架,可减轻血流冲击对瓣叶的损害,同时去除硬质瓣环后手术时可以植入口径更大的瓣膜,改善了血流动力学,较传统双层缝合瓣膜缩短了植入时间。经体外流体力学测试及疲劳测试,结果满意。但无支架生物瓣膜植入手术操作时间长、术后长期临床效果及耐久性尚需进一步临床结果验证。     

利用自体富血小板血浆构建凝胶生物细胞支架的实验研究

目的分析富血小板血浆（PRP）凝胶作为组织工程细胞支架的可行性。方法抽取兔静脉血Eendersberg法制备PRP,测定PRP中血小板浓度,将PRP经激活剂激活后制备PRP凝胶生物细胞支架（PRG）,并进行扫描电镜观察。将兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）与PRG共培养,消化后将BMSCs接种再培养,观察BMSCs活性。结果通过Lendersberg两步离心法顺利制得PRP,血小板浓度与全血相比增加了3．74倍,PRP经过激活后5—10min形成胶冻状PRG,扫描电镜结果显示其具有复杂的立体网状结构,孔隙直径约50—100微米。兔BMSCs在PRG中培养3天后扫描电镜观察结果显示在PRG三维结构中,兔BMSCs在纤维素支架上附着良好,培养1周后将兔BMSCs消化分离后再接种培养,兔BMSCs生长良好。结论自体富血小板血浆凝胶生物细胞支架来源于自体,无免疫源性,本身含丰富的细胞生长因子,同时具有完整的三维结构和良好的组织相容性,是一种优良的组织工程细胞支架,具有良好的应用前景。