大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中扩增出长约１．４Ｋｂ的色氨酸酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ３ａ的ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ位点,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,构建高产色氨酸酶基因工程菌。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和薄层扫描表明,工程菌色氨酸酶的表达量占细胞总可溶性蛋白的６９．８％。酶活测定结果表明,７株工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中ＷＷ－１１号比宿主菌高１６倍。     

一株表达延胡索酸水合酶的基因工程菌的构建

应用ＰＣＲ技术从大肠杆菌染色体ＤＮＡ中扩增出了长约１．８ｋｂ的ｆｕｍＡ基因片段,将其插入到ｐＵＣ１９载体中,转化大肠杆菌ＪＭ１０５,最后筛选出一株延胡索酸水合酶高产菌,命名为ＣＰＵ－Ｗ－９２１１,该菌的延胡索酸水合酶活力比ＪＭ１０５提高约６倍。从ＣＰＵ－Ｗ－９２１１里提取的质粒ｐＵＦ５２作为ＰＣＲ扩增的模板,以合成的ｆｕｍＡ基因两侧各长２４个核苷酸的片段为引物,可以扩增出１．８ｋｂ的ｆｕｍＡ片段;用限制性内切酶也可以从ｐＵＦ５２中切出一个接近１．８ｋｂ的插入片段。     

色氨酸酶基因工程菌酶法合成L-色氨酸

目的 :以Ｌ 丝氨酸和吲哚为底物 ,用色氨酸酶基因工程菌酶法合成Ｌ 色氨酸。方法 :以ＩＰＴＧ诱导工程菌色氨酸酶表达 ,将酶活最高时的工程菌游离细胞作为转化反应的酶源 ,通过纸层析分析并测定转化液中Ｌ 色氨酸的含量。结果 :10 0ｍｌ反应液 (Ｌ 丝氨酸 3ｇ ,吲哚 3ｇ) 37℃反应 48ｈ可积累Ｌ 色氨酸 4.9ｇ ,Ｌ 丝氨酸转化率为84 2 % ,吲哚转化率为 93 6 %。经分离纯化所得的Ｌ 色氨酸晶体 ,在熔点、旋光性和红外吸收光谱等方面与标准品完全一致。结论 :色氨酸酶基因工程菌能有效地催化Ｌ 丝氨酸和吲哚合成Ｌ 色氨酸 ,进一步证明了该酶在…     

色氨酸酶基因工程菌酶法合成L-色氨酸

目的 :研究萘普生缓释片和普通片多剂量口服的体内药代动力学。方法 :根据生物利用度试验方法 ,比较了健康志愿受试者多剂量口服萘生缓释片和普通片的体内药动学过程。结果 :多剂量口服萘普生缓释片 (2× 2 5 0ｍｇ ,ｑｄ)和普通片 (2 5 0ｍｇ ,ｂｉｄ)达稳态后的ＡＵＣ0→ 2 4 分别为 (115 3.5 7± 15 4.95 )和 (10 38.40± 2 0 1.19) (μｇ·ｈ) /ｍｌ,Ｃｍａｘ分别为 (70 .72± 13.2 2 )和 (73.0 5± 13.82 ) μｇ/ｍｌ,Ｔｍａｘ分别为 (7.6± 2 .7)和 (2 .0± 0 .9)ｈ ,波动系数 (ＦＩ)分别为 0 .85± 0 .16和 1.0 1± 0 .18。结论 :缓…     

基因工程菌CTB2的固定化及其制备L—苯丙氨酸的研究

对以卡拉胶为载体固定化基因工程菌ＣＴＢ２制备Ｌ－苯丙氨酸进行了研究。比较了固定化细胞的最适温度和最适ＰＨ,考察了该固定化细胞的柱以应特性以及产物Ｌ－苯丙氨酸的分离方法。结果表明,固定化细胞的最适温度为３０℃,最ＰＨ为７．０,柱反应最佳空时速度ＳＶ＝０．１９ｈ＾－１底转化率为２０％,固定化酶半衰期大于３０ｄ。     

色氨酸酶基因工程菌固定化及其培养条件的研究

目的 :观察具有较强钙调素拮抗活性的双苄基异喹啉类化合物Ｅ6对缺血性神经损伤的保护作用。方法 :采用ＮａＣＮ加缺糖引起肾上腺髓质瘤细胞 (ＰＣ12细胞株 )损伤和谷氨酸 (ｇｌｕｔａｍａｔｅ ,Ｇｌｕ)引起乳大鼠脑皮质神经细胞损伤模型。结果 :Ｅ6对ＮａＣＮ加缺糖损伤的ＰＣ12细胞保护作用较弱 ,而对Ｇｌｕ损伤的原代皮质细胞有较强的保护作用 ,并降低培养液中一氧化氮 (ＮＯ)的含量。ＮＯ合成前体Ｌ 精氨酸 (Ｌ ａｒｇｉｎｉｎｅ ,Ｌ Ａｒｇ)可减弱Ｅ6的保护作用。Ｅ6对硝普钠 (ｓｏｄｉｕｍｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ ,ＳＮＰ)损伤的…     

色氨酸酶基因工程菌固定化及其培养条件的研究

目的 :对色氨酸酶基因工程菌ＷＷ 11进行固定化及培养条件研究 ,为工业化生产Ｌ 色氨酸奠定基础。方法 :通过色氨酸酶活力测定 ,考察三种固定化材料及温度、ｐＨ、单价阳离子降乙醇对固定化ＷＷ 11色氨酸酶活力的影响。结果 :以聚乙烯醇作为ＷＷ 11的固定化载体 ,其活力回收为 6 0 9%。固定化ＷＷ 1色氨酸酶降解反应最适 ｐＨ为 9 0、最适温度为 5 0℃ ;固定化ＷＷ 1色氨酸酶合成反应最适 ｐＨ为 7 5、最适温度为 45℃。Ｋ 、ＮＨ 4对固定化工程菌色氨酸酶有明显激活作用 ,而Ｎａ 则有一定的抑制作用。结论 :固定化工程菌色氨酸酶对温度…     

肌酐水解酶基因工程菌的构建及功能研究

目的 构建肌酐水解酶的重组质粒转染至大肠杆菌中,研究其蛋白的表达及活性。方法根据Genbank上肌酐水解酶基因序列(D45424.1),进行生物合成,得到肌酐水解酶基因片段C,聚合酶链反应(PCR)扩增后,与质粒GV296连接,构建成重组质粒GV296-C,转染至大肠杆菌BL21(DE3),构建成基因工程菌GV296-C/BL21(DE3)。进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分析后,测定培养液肌酐浓度变化。结果成功构建重组质粒GV296-C,电泳显示目的片段约为0.783Kb,测序结果与D45424.1基因序列一致。重组质粒GV296-C转染至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量约为29KD。结论成功构建工程菌GV296-C/BL21(DE3),诱导后高效表达肌酐水解酶,具有水解肌酐活性。     

家蚕基因工程表达系统的病原体检测

家蚕基因工程表达系统是在真核生物整体水平进行的外源基因表达系统,必须对其安全性进行研究,以确保该表达系统及其产品对人的安全。本室工作人员用ＰＣＲ扩增技术及细菌培养方法对家蚕的多种成份进行了人类常见病原菌及病毒和支原体的检测,结果表明,家蚕的多种成分未分离到常见的病原菌,病毒等其它病原体。除ＥＢ,ＨＰＶ病毒ＰＣＲ检测榇一有一区带出现外,其余都为阴性。     

基因工程苯丙氨酸解氨酶对多发性骨髓瘤U266细胞的作用研究

目的 为寻找对多发性骨髓瘤新的治疗方法 ,从基因工程乳酸乳球菌提纯苯丙氨酸解氨酶(PAL),探讨PAL酶对多发性骨髓瘤U266细胞系的影响作用.方法 利用已构建成功的高表达PAL的基因工程乳酸乳球菌,结合物理、化学、生物学等方法 ,设计一种简便、高效提纯PAL酶的方法.培养人多发性骨髓瘤U266细胞系,在不同浓度基因工程PAL酶作用后.以MTT法检测细胞增生;流式细胞仪检测细胞凋亡;HPLC检测细胞培养液中苯丙氨酸(phe)浓度.结果 ①用本研究所设计方法 从基因工程乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-palart中提取的PAL酶比活性可达同量原菌的92.5%;②0.1～2.0U/ml的PAL提取液作用24h后能显著抑制U266细胞生长,并呈剂量依赖性;③只添加提取过程所用试剂的对照组细胞生长无明显抑制;④0.1U/ml、0.2U/ml、2.0 U/ml的PAL酶作用24h后的MM细胞早期凋亡率分别为(21.92±0.95)%、(50.64±0.86)%、(90.86±2.91)%;⑤PAL酶作用24h后细胞培养液中phe浓度随PAL酶活性增加而降低.结论 本研究所设计方法 可从基因工程乳酸菌高效提取PAL酶;提取过程中的添加试剂对MM细胞生长无明显抑制作用;PAL酶能显著抑制MM细胞体外生长,诱导细胞早期凋亡;PAL酶可降低培养液中的phe水平,且phe浓度与MM细胞生长的抑制作用具有相关性.     

pTWIN质粒的改造及凋亡素组合肽基因工程菌的构建

目的构建凋亡素组合肽基因工程菌,改善组合肽的纯化工艺。方法以pTWIN1质粒为表达载体,构建凋亡素组合肽基因工程菌,对质粒进行改造,用6-His取代几丁质结合蛋白,实现用镍离子柱替换几丁质柱,一次层析纯化组合肽。结果构建了高水平表达凋亡素组合肽的基因工程菌;对pTWIN1质粒进行改造,用镍离子柱替代几丁质亲和柱纯化组合肽,实现了通过镍离子柱一次层析直接获得组合肽,内含肽自动断裂,不需要酶切,改造后的pTWIN1载体适用于凋亡素组合肽的开发,建立了纯化重组凋亡素组合肽方法。结论成功构建了高水平表达凋亡素组合肽的基因工程菌,成功地对pTWIN1质粒进行改造,为在生产中用镍离子柱纯化组合肽降低成本奠定了基础。     

用于生产L－苯丙氨酸的基因工程菌的构建

用于生产Ｌ－苯丙氨酸的基因工程菌的构建史燕东,吴梧桐,周艳,张玉彬,龚韬．药物生物技术,１９９４,１（１）：８～１３用含ｔｙｒＢ基因（在大肠杆菌中编码芳香族氨基酸转氨酶）的质粒ｐＫＢ７转化不同的宿主菌,筛选出ＣＴＢ２菌（ＰｋＢ７转化ＪＭ１０７得到）表...     

-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌对乳糖细胞毒性的缓解作用

目的体外评价Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌缓解乳糖对细胞毒性作用的效果。方法建立乳糖细胞毒性作用CACO-2细胞模型,采用形态学观察及细胞增殖活性等指标检测该菌对乳糖细胞毒性的作用效果。结果成功建立乳糖细胞毒性作用CACO-2体外模型,所构建的Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌能够保护细胞耐受乳糖毒性而呈现正常形态,并能提高乳糖作用下的细胞活性(P<0.01)。结论Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌在体外可显著的降低乳糖的细胞毒性作用,为进行其食品级改造奠定了基础。     

以pET-SUMO质粒为载体的凋亡素组合肽基因工程菌的构建

目的 构建以pET-SUMO为载体的凋亡素组合肽基因工程菌,建立简便易行、能够放大的重组凋亡素组合肽纯化方法和工序.方法 以pET-SUMO质粒为表达载体,构建凋亡素组合肽基因工程菌,通过镍柱纯化、SDS-PAGE、小肽电泳检测重组凋亡素组合肽表达水平,选取适合转化、生产需求的基因工程菌株.结果 测序证实凋亡素组合肽与...