多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6和TNF-α的表达及其临床意义

目的 研究骨髓瘤骨髓基质细胞(BMSCs)分泌的白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在多发性骨髓瘤(MM)进展中的变化和意义以及人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)分泌IL-6和TNF-α的水平.方法 用ELISA法检测单独培养的hUCBDSCs 和骨髓瘤BMSCs以及它们与KM3细胞共培养后IL-6 、TNF-α在培养上清液中的浓度.结果 (1)单独培养和共培养时骨髓瘤BMSCs分泌IL-6和TNF-α的水平高于hUCBDSCs;(2)共培养后骨髓瘤BMSCs和hUCBDSCs分泌IL-6和TNF-α的水平明显高于共培养前;(3)Ⅲ期患者BMSCs分泌IL-6的水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,但是TNF-α水平无变化.结论 IL-6与MM的进展有关;hUCBDSCs表达IL-6和TNF-α的水平较骨髓瘤BMSCs低.     

白血病骨髓基质细胞促进Jurkat细胞抗药物诱导凋亡研究

目的探索骨髓基质细胞增强白血病细胞抗凋亡、抗药特性的可能机制.方法体外分离培养骨髓基质细胞模拟骨髓微环境功能,与白血病细胞Jurkat体外共培养.0.5 μmol/L DNR处理Jurkat 细胞诱导凋亡,应用Annexin V/PI 双标法流式细胞仪检测白血病细胞凋亡率.PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 0.1～2.0 μmol/L浓度范围DNR作用一定时间后,Jurkat细胞发生的凋亡率随药物浓度的增加与作用时间的延长而升高.共培养后骨髓基质细胞抑制药物诱导的白血病细胞凋亡,白血病细胞凋亡率明显低于单独悬浮培养组(P<0.05).白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞[白血病细胞凋亡率分别是(5.73±1.78)%, (8.39±4.08)%, (P<0.05)].DNR处理共培养组Jurkat细胞G0/G1期阻滞,而正常与白血病骨髓基质细胞屏蔽的白血病细胞G0/G1期阻滞现象无显著性差异(P>0.05).结论一定浓度的DNR在体外可诱导Jurkat细胞凋亡.骨髓基质细胞抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡,这种保护作用可能部分通过阻滞白血病细胞于G0/G1期实现.白血病骨髓基质细胞对白血病细胞的屏蔽效应可能存在较细胞周期阻滞更复杂的机制.     

骨髓基质细胞保护药物诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的机制研究

目的研究原代正常骨髓基质细胞对多发性骨髓瘤细胞的保护作用及其内在机制。方法脂质体介导Notch1特异性小干扰RNA转染多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞与骨髓基质细胞共培养,采用细胞形态学观察和流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Notch1及NF-κB p65蛋白表达变化。结果多发性骨髓瘤细胞与基质细胞共培养增加了Notch1活化形式(N1-ICD)蛋白的表达;共培养组与悬浮培养组药物诱导的细胞凋亡率分别为(15.30±2.21)%、(32.88±3.27)%;小干扰RNA有效的下调Notch1蛋白的表达;干扰共培养组与控制共培养组细胞的凋亡率分别为(41.47±4.01)%和(24.89±3.68)%;下调Notch1后NF-κB p65蛋白表达没有改变。结论骨髓基质细胞保护药物诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡,该保护作用通过激活Notch1通路实现。下调Notch1共培养恢复药物诱导的凋亡作用不是通过NF-κB通路,可能存在其他机制。     

白血病骨髓基质抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡

目的探索骨髓基质细胞增强白血病细胞抗凋亡、抗药特性的可能机制.方法应用Percoll分离骨髓单个核细胞体外培养骨髓基质细胞模拟骨髓微环境功能,与白血病细胞株Jurkat细胞体外共培养.0.5μmol/L DNR处理Jurkat细胞诱导凋亡,应用Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测白血病细胞凋亡率.PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布.结果0.1～2.0μmol/L浓度范围DNR作用一定时间后,Jurkat细胞发生的凋亡率随药物浓度的增加与作用时间的延长而升高.共培养后骨髓基质细胞抑制药物诱导的白血病细胞凋亡,与单独悬浮培养组比较白血病细胞凋亡率有显著降低(8.39±4.08)%比(16.02±1.00)%,P＜0.05.白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞(白血病细胞凋亡率分别是(5.73±1.78)%比(8.39±4.08)%,P＜0.05.DNR处理共培养组Jurkat细胞G0/G1期比例高于悬浮培养DNR处理组,而正常与白血病骨髓基质细胞屏蔽的白血病细胞G0/G1期阻滞现象无显著性差异(47.96±5.88)%比(39.25±3.04)%,P＞0.05.结论一定浓度的DNR在体外可诱导Jurkat细胞凋亡.骨髓基质细胞抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡,提示骨髓微环境在骨髓白血病细胞获得耐药、抗凋亡特性以及残留白血病形成过程中起着重要促进作用.细胞周期分布实验结果显示骨髓微环境对白血病细胞的保护作用可能部分通过阻滞白血病细胞于G0/G1期实现.实验结果提示,白血病骨髓基质细胞对白血病细胞的屏蔽效应可能存在较细胞周期阻滞更复杂的机制.     

Cx43修饰人脐血源基质细胞输注阻抑白血病MRD小鼠造血干细胞移植后复发

目的 观察间隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)修饰人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs)体外对L615小鼠白血病细胞株凋亡以及在体对白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)小鼠疾病进展的影响.方法 通过Cx43过表达腺病毒(Ad-Cx43-GFP)上调hUCBDSCs中Cx43表达,体外构建L615+Cx43+hUCBDSCs共培养模型,检测其对L615细胞凋亡的影响.建立L615细胞低瘤负荷的MRD小鼠模型,分为骨髓(bone marrow,BM)移植组和Cx43+hUCBDSCs+ BM移植组进行移植,以正常L615小鼠作为对照,检测移植后外周血象、骨髓涂片、组织病理及骨髓Cx43表达变化等.结果 Ad-Cx43-GFP能够在mRNA和蛋白水平显著上调hUCBDSCs中Cx43表达.L615+Cx43+hUCBDSCs移植组L615细胞凋亡比例较对照组显著升高[(8.93±1.24)％ vs(3.53±0.13)％,P＜0.01].对MRD小鼠移植后,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组外周血WBC和PLT恢复更快,17d时接近正常水平,而BM移植组外周血WBC和PLT恢复延迟,17 d时低于正常水平;17 d时,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组骨髓涂片原始细胞比例较BM移植组显著降低[(7.67±1.25)％ vs (56.33±1.25)％,P＜0.01];与BM移植组比较,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组肝、脾、骨髓的白血病浸润程度较低,同时骨髓中Cx43蛋白表达增加.结论 上调hUCBDSCs中Cx43表达能在体外促进L615细胞凋亡,Cx43+hUCBDSCs+BM联合移植能够促进MRD小鼠外周血WBC和PLT恢复,阻抑MRD小鼠移植后复发.     

IFN-γ基因修饰的骨髓基质细胞体外抗白血病作用的实验研究

目的研究重组人IFN-γ腺病毒(Ad/hIFN-γ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFN-γ表达,并进一步观察转染Ad/hIFN-γ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用. 方法以Ad/hIFN-γ重组腺病毒按感染复数(MOI)为50转染CML病人骨髓基质细胞,RT-PCR、ELISA及Western blot分别检测转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFN-γ mRNA和IFN-γ的表达;转染Ad/hIFN-γ的骨髓基质细胞与K562细胞共培养,通过绘制K562细胞生长曲线分析其对K562细胞增殖的影响;并进一步通过流式细胞学分析其对K562细胞周期的影响和诱导凋亡的作用.结果 RT-PCR、Western blot及ELISA方法都分别检测到转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFN-γ mRNA和IFN-γ的表达;与对照组相比,转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞的实验组具有明显的抑制K562细胞增殖的作用(P=0.000),在细胞周期G1期的K562细胞比例明显增加,而S期K562细胞比例显著下降(P<0.01),并显著诱导K562细胞的凋亡(P<0.01).结论 Ad/hIFN-γ转染人骨髓基质细胞后可获得IFN-γ有效的表达,并在体外能有效地发挥抗白血病细胞作用.     

骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究

目的在分子生物学水平上探讨体外培养的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达TPO、GM-CSF、SCF的mRNA的能力的差异.方法收集培养28d的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞,采用RT-PCR方法在mRNA水平上分析其造血生长因子GM-CSF、SCF、TPO的表达,比较二者表达TPO、GM-CSF、SCF等造血生长因子的mRNA能力的差异.结果体外培养的人脐血基质细胞与骨髓基质细胞均能表达:(1)TPO的mRNA,人脐血基质细胞表达能力强于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为1.57;(2)SCF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.83;(3)GM-CSF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.68.结论人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可以表达造血生长因子TPO、GM-CSF、SCF的mRNA,具有支持调控造血的物质基础.     

上调白血病骨髓基质细胞GJIC功能对Jurkat细胞药物敏感性的影响

目的 观察上调白血病骨髓基质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能对共培养的人急性淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat)细胞药物敏感性的影响.方法 体外培养白血病骨髓基质细胞,转染Cx43基因,罗氏黄染料传输法检测转染后骨髓基质细胞的GJIC功能变化;将Jurkat细胞与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养,观察共培养的Jurkat细胞对化疗药物甲氨蝶呤(MTX)药物敏感性的改变.结果 转染Cx43基因的白血病骨髓基质细胞的GJIC功能明显增加;与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞在MTX作用下的存活率(61.3±3.24)%较未转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞(82.4±3.12)%明显下降;与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞在MTX作用下的凋亡率(48.1±3.78)%较与未转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞(18.5±3.43)%明显增加,差异有统计学意义(P<0.01).结论 上调白血病骨髓基质细胞GJIC功能能够增加共培养的Jurkat细胞对化疗药物的敏感性.     

人脐血源基质细胞对小鼠淋巴细胞增殖作用的研究

目的 探讨人脐血源基质细胞对小鼠淋巴细胞的增殖作用.方法 将培养的人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)与分离的小鼠脾脏淋巴细胞进行混合培养,采用CCK-8检测淋巴细胞增殖,流式细胞仪检查细胞周期.结果 hUCBDSCs组OD值明显高于时照组(P＜0.05),rhIL-2 hUCBDSCs组OD值更高(P＜0.05),而细胞因子作用(hUCBDSCs培养上清液)组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).实验(混合培养)组淋巴细胞S G2/M期明显高于对照(单纯培养)组(P＜0.05).结论 hUCBDSCs具有促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖作用.     

川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用

目的:探讨川芎嗪对缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠肾功能、肾脏组织形态学、细胞凋亡及相关基因表达的影响.方法:将大鼠随机分为假手术(S)组、I/R组、再灌注后给予川芎嗪(IMP-post)组、再灌注前给予川芎嗪(IMP-pre)组,各组分别采用化学法测定血尿素氮和肌酐,光镜和电镜观察肾组织形态学变化,原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡指数,免疫组化和免疫印迹法检测肾脏Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果:TMP-pre组较I/R组血尿素氮和肌肝显著降低,肾小管损伤评分减轻,分别为[(21.8±5.2)vs(31.1±4.4)mmol/L,P<0.01)],[(196±55)vs(295±64)μmol/L,P<0.01)],[(372±46)vs(563±62),P<0.01)];肾小管上皮细胞损伤及超微结构改变明显减轻,肾组织凋亡细胞数明显减少[(13.6±2.9)vs(28.8±4.6),P<0.01)];Bcl-2蛋白表达明显增强[(1.15±0.12)vs(0.88±0.12),P<0.05)],Bax表达明显减弱[(0.87±0.11)vs(1.15±0.09),P<0.05)].结论:川芎嗪可明显减轻I/R肾损伤,其保护作用机制与Bcl-2蛋白表达增强和Bax蛋白表达减弱介导的肾脏细胞凋亡;保护有关.     

大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞的分化。方法： 用DMEM培养液冲洗骨髓,收集骨髓细胞接种在培养瓶中体外扩增、纯化。用诱导剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化ABC法鉴定神经丝蛋白（NF-200）、微管相关蛋白（MAP-2）、神经元特异核蛋白（NeuN）、巢蛋白(Nestin) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAD和ChAT的表达。结果： BMSCs经诱导后,胞体增大,并伸出细长突起,与神经元形态相似。免疫组化显示大部分细胞NF-200,MAP-2,NeuN和Nestin表达阳性,(3±0.8)%的细胞GAD表达阳性,(5±0.3)%的细胞ChAT表达阳性,而GFAP 表达阴性。结论： BMSCs可被诱导分化为神经元样细胞,部分细胞可表达GAD与ChAT。     

正常骨髓基质细胞对K562细胞凋亡敏感性的影响

目的观察正常人骨髓基质细胞对白血病敏感细胞株K562细胞凋亡易感性的影响,并研究其作用机制。方法建立正常人骨髓基质细胞的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系;流式细胞仪检测Annexin V阳性的早期凋亡细胞;电镜下观察凋亡形态学改变;流式细胞仪检测bcl-2,活化的胱冬氨酸蛋白酶（caspaae）-3的表达变化。结果与单独K562细胞培养相比,与正常人骨髓基质细胞共培养的K562细胞,分别经阿糖胞苷作用后,共培养体系下其凋亡率下降,电镜下细胞凋亡的形态改变减少或消失,而且bcl-2蛋白表达上调,活化的caspase-3表达减弱。结论正常人骨髓基质细胞可促进白血病细胞株K562细胞的增殖,降低K562细胞对阿糖胞苷的凋亡易感性,其作用机制中包括影响凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3的表达。     

APE1/Ref-1 siRNA抑制多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6及IL-8分泌的体外研究

目的 体外通过APE1/Ref-1 siRNA敲低多发性骨髓瘤骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)APE1/Ref-1的表达,观察BMSCs的增殖及分泌细胞因子IL-6、IL-8的变化,初步探讨BMSCs APE1/Ref-1表达的功能特点.方法 通过免疫细胞化学染色法定量榆测35例初治、11例复发/难治多发性骨髓瘤患者及10例正常人BMSCsAPE1/Ref-1的表达特点及其差异,经Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后,流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;ELISA法检测BMSCs分泌IL-6、IL-8的水平变化情况.结果 多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1蛋白阳性表达率显著高于正常BMSCs APE1/Ref-1蛋白阳性表达率(P<0.05),且多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1呈细胞核及核浆共间表达方式.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染敲低多发性骨髓瘤及正常BMSCs APE1/Ref-1的表达量呈进行性减少(P<0.01),同时发现APE1/Ref-1 siRNA对多发性骨髓瘤BMSCs抑制作用更明显.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后对正常人及骨髓瘤患者BMSCs分泌细胞因子IL-6、IL-8的量有显著的抑制作用,特别是感染72 h后,骨髓瘤患者及正常人的BMSCs分泌IL-6[初治患者(246.29±46.51)pg/ml,复发/难治患者(365.09±75.25)pg/ml]、IL-8[初治患者(118.77±18.08)pg/ml,复发/难治患者(188.71±33.76)pg/ml]的量最低,与其他时段比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 多发性骨髓瘤BMscs APE1/Ref-1的表达特点不同于正常BMSCs,可能导致其功能差异;APE1/Ref-1 siRNA敲低了MM BMSCsAPE1/Ref-1的表达,同时明显抑制了其IL-6、IL-8的分泌,减少了对骨髓瘤细胞的促增殖和凋亡作用.     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞体外表达的实验研究

目的探讨促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因修饰的小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外表达TPO的变化特点。方法以脂质体介导法将TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达,免疫组化法及Western blot测定TPO蛋白的表达。结果转染TPO基因的BMSCs其TPO mRNA及TPO蛋白表达量明显高于空载体组(P<0.01)及未转染组(P<0.01)。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO蛋白的表达显著上调。     

骨形态反应蛋白-2对骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养向软骨细胞分化的影响

目的研究细胞因子骨形态反应蛋白-2(BMP-2)与软骨细胞共同诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化是否有协同作用,并检测BMP-2对BMSCs和软骨细胞共培养诱导分化为软骨细胞的最佳浓度。方法将体外分别培养扩增的兔BMSCs和软骨细胞按相同的比例(7∶3)混合后,均以5.0×107.mL-1的细胞浓度接种混合培养,根据不同的BMP-2浓度分为以下几组,5、10、20、30、40、50 ng/mL组,以单独培养的软骨细胞作为阳性对照组,以单独培养的BMSCs作为阴性对照组,以混合培养后不加BMP-2作为0 ng/mL组。通过MTT、Ⅱ型胶原蛋白表达以及糖胺聚糖蛋白表达的检测,确定BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs是否有协同作用及促进BMSCs向软骨细胞转化的最佳BMP-2浓度。结果单独培养BMSCs的阴性对照组向软骨细胞分化的倾向不明显,而与软骨细胞混合培养的0 ng/mL组软骨细胞增多,添加BMP-2的5、10、20、30、40、50 ng/mL组向软骨细胞分化更加明显。结论 BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs对于其向软骨细胞分化有协同作用,BMP-2的最佳作用浓度为20 ng/mL。     

腺病毒介导CTLA4Ig基因转染骨髓基质细胞及其对CD34+细胞粘附力的影响

目的：通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞）Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的表达，探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力的变化，方法：以CTLA4Ig－重组腺病毒按感染复数（Mutiplicity of infetion,MOI)50转染BMSCs，免疫组的^3H-TdR标记CD34^ 细胞的cpm值观察CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞的粘附力变化，结果：免疫细胞化学染色示CTLA4Ig表达阳性率达85％（MOI＝50），弥漫性定位于细胞质，免疫磁体阳性选择获取的骨髓CD34^ 细胞纯度可高达97．8％，转染组与对照组BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力无显著差异（P＞0．05）。结论：CTLA4Ig－重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中表达，并对其粘附力无显著影响。     

聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

目的:观察聚己内酯(PCL)电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响,评价其作为骨组织工程的支架材料的应用前景.方法:将兔BMSCs与PCL电纺纤维支架材料在培养板内共培养.采用形态学观察、MTT法及ALP检测等方法检测BMSCs在PCL电纺纤维表面的粘附、增殖和分化能力.结果:体外培养的BMSCs能在PCL电纺纤维表面正常粘附和增殖,并且表达较高的碱性磷酸酶活性.结论:PCL电纺纤维适合作为支架材料应用于BMSCs为种子细胞的组织构建.     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。