湖南省20株狂犬病毒株与疫苗株N基因序列分析

目的 分析湖南省狂犬病毒株与疫苗株的N基因序列及遗传进化关系,从基因角度解决疫苗的选择问题,为狂犬病的防治提供科学依据.方法 采用KT-PCK法从市售家犬脑组织标本内获得N基因并进行测序,采用DNAStar软件包中的MegAlign软件,将所得结果与国内外发表的代表性疫苗株相应基因进行核苷酸、氨基酸序列同源性比对分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发生树.结果 湖南省20株狂犬病毒与国内外13株疫苗代表的株核苷酸同源性在85.3%～94.2%(中位数88.6%).相应地,N基因编码的氨基酸序列同源性为95.4%～99.6%(中位数99.2%).其中,与中国疫苗株CTN、SRV-9,国外疫苗株CVS、RBE3-15、SADB19-1st及HEP-Fllury株的氨基酸序列同源性范围在99.2%～99.6%,并以与CTN疫苗株同源性中位数最高(90%).系统发生分为两大群.湖南省20株研究毒株与中国人用CTN株具有很高的亲缘性,构成第一群.其余的疫苗毒株构成第二基因群.结论 湖南省狂犬病毒株与中国人用疫苗株CTN同源性最高、亲缘关系最近,因此在湖南省使用CTN疫苗株效果可能较好.     

细胞因子基因修饰人口腔鳞癌细胞株的建立及鉴定

用ＰＡ３１７包装的携带人ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α或ＩＬ－２ｃＤＮＡ３种逆转录病毒载体用来转染人口腔鳞癌细胞株Ｔｃａ－８１１３。经新霉素衍生物Ｇ４１８筛选出抗性克隆并扩增产生子代株。ＰＣＲ和细胞因子生物活性测定证实细胞因子基因整合入基因修饰细胞并通过细胞分泌相应活性蛋白产物。本研究显示对口腔鳞癌细胞的逆转录病毒介导细胞因子的基因转移方法切实、可靠。基因修饰细胞株的建立为研究其生物学行为提供了实验对象。     

重组汉滩病毒核蛋白及其26 ku片段的免疫学特性初步鉴定

目的 研究基因重组表达的汉滩病毒核蛋白及其氨基端２６ｋｕ片段在刺激机体免疫应答中的作用,为汉滩病毒基因工程疫苗研究打下基础。方法 采用基因重组技术和新和层析技术对汉滩病毒核蛋白及其氨基端２６ｋｕ片段进行表达和纯化,并通过体外和体内试验对上述表达产物刺激小鼠免疫应答的作用及其特性进行了初步鉴定。结果 汉滩病毒核蛋白及其２６ｋｕ片段对小鼠均具有较强的免疫原性。ＥＬＩＳＡ检测免疫鼠抗体滴度可达１：３２０     

人PCAN1基因启动子的克隆及其上游调控区域的鉴定

目的克隆人前列腺癌基因1（PCAN1）5′上游2.6?kb启动子片段,构建pGL3 p2.6?kb载体, 测定其启动子活性,初步鉴定该片段内的DNA调控区域。方法采用PCR法从人基因组DNA中扩增PCAN1基因5′上游2.6?kb启动子片段,并构建到荧光素酶报道基因载体pGL3 basic中,构成pGL3 p2.6?kb;瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP,通过双荧光素酶活性检验测定PCAN1启动子活性。 使用Erase a system对pGL3 p2.6kb载体中2.6?kb片段进行一系列5′侧翼缺失,产生12个缺失体,分别瞬时转染LNCaP细胞,通过检测荧光素酶的活性观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响。结果克隆的PCAN1 2.6?kb启动子片段经测序鉴定正确无误; pGL3 p2.6?kb转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定结果显示2.6?kb片段具有明显的启动子活性;5′缺失突变分析显示,PCAN1基因上游-1?599?bp?至-1?541?bp、-347?bp至-84?bp的缺失,与2.6?kb?片段相比,启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍,-1?541?bp?至-1?226?bp的缺失,与2.6?kb片段相比,启动子活性降低2.11倍。结论 克隆的人PCAN1基因5′上游2.6?kb片段具有较强的启动子活性,PCAN1基因上游2.6?kb区域内分别存在2个负调控区和1个正调控区。     

中国狂犬病毒疫苗株(3aG)糖蛋白基因的核酸和氨基酸序列的测定和分析

本文报告了中国狂犬病疫苗株(3aG)糖蛋白基因的核酸序列和氨基酸推导序列.完整的糖蛋白基因从起始密码 ATG 到终止密码 TGA 共有1575个核苷酸碱基,编码形成524个氨基酸碱基的多肽链.四种核苷酸的组成分别为:腺嘌呤(A)占27%,胸腺嘧啶(T)占26%,胞嘧啶(C)占22%,鸟嘌呤(G) 占25%.3aG 株的糖蛋白全基因的核酸序列与巴斯德株(PV)和国际标准攻击毒株(CVS)的糖蛋白基因序列的同源性分别为91.17%和89.44%.其氨基酸推导序列与 PV 株和 CVS 株相比,同源性分别为89.89%和86.83%.3aG 株有三个糖基化位点,分别位于第37,247和319位的氨基酸碱基上.糖蛋白膜外区部分特点抗原位点比较显示3aG 和 PV 株及 CVS 株有高度同源性.     

人身高差异的分子遗传学研究进展

流行病学调查证实遗传因素在人身高发育中具有重要作用。研究发现,约80%的身高与遗传因素有关,其余20%左右的影响来源于环境因素。目前有关身高的遗传学研究已得到不断的发展,但确切的机制还不明确。现回顾国内外文献,就身高相关的全基因组连锁分析、候选基因关联研究的进展进行简要综述,并对研究中存在的问题及今后的发展方向进行简要总结。     

江苏省输入性登革热1例病毒分离鉴定及分子特征分析

目的:从江苏省2012年4月1例菲律宾输入的疑似登革热患者急性期血清中分离病毒并分析其分子生物学特征,以找出病原学证据?方法:收集患者血清样本,采用胶体金法检测登革病毒的IgM?IgG抗体;用C6/36细胞分离病毒,对细胞病变的标本进行RT-PCR及荧光定量PCR检测登革病毒RNA和鉴定型别;采用高通量测序技术对该分离株进行编码区基因测序,用MEGA6.0软件对其进行序列比对和进化分析?结果:从患者血清样本中检测到登革病毒的IgM抗体,分离到的毒株经鉴定为登革病毒1型,与美国HawO3663毒株的核苷酸同源性>98%?结论:该病例是由登革病毒1型引起的输入性病例?     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的 表达狂犬病病毒糖蛋白(GP),用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究. 方法 采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法 扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a.将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的 蛋白,进行SDS-PAGE分析.表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析.结果 成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp.SDS-PAGE分析结果 证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103.Western blot鉴定结果 表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应.结论 利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性.     

中国大陆EV71病毒分离株的分子流行病学研究

目的 了解1987-2010年中国大陆肠道病毒71型(EV71)分离株的分子流行病学特点及其种系进化、基因分型和遗传变异性.方法 从GenBank/NCBI上获得中国大陆来源的具有完整VP1或近似完整VP1基因的核苷酸序列信息的413株EV71毒株进行分析,采用MEGA 5.0软件,构建系统进化树,计算相同或不同基因型及基因亚型毒株的核苷酸与氨基酸的相似性.结果 1987-2010年,中国大陆20个省、市或地区均分离到具有完整VP1序列的毒株,且2008年以来数量陡增;中国大陆流行的主要是C型,只有2008年安徽和2009年湖北发现了A型;各基因型在43、58、142、164、167、184、240、249、292等氨基酸位点发生了特异性变异;从健康人体内分离的HQ129932毒株与其他序列比较,氨基酸无特异性变异.结论 C型株可能具有更强的传染力;氨基酸位点变异对于EV71病毒进化有重要意义;VP1基因与疾病的严重程度无明显关联;应加强C4a亚型疫苗候选疫苗株对其他基因型毒株的交叉保护作用研究.     

不同疫区家犬携带狂犬病毒的比较研究

目的比较河南和陕西两省外观健康的家犬狂犬病毒携带率,为加强当前犬只管理、控制我国狂犬病不断上升的疫情提供参考依据。方法调查河南和陕西两省近年来人间狂犬病疫情;分别采集河南和陕西两省外观健康的家犬脑组织样品121份和645份,以免疫荧光实验（IFA）、小鼠颅内接种试验（MIT）以及逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测样品带毒情况;以MEGA及DNAStar等生物信息学软件对病毒核蛋白基因进行分析。结果从河南省121份犬脑样品中栓出阳性结果9份,陕西省645份样品无阳性;9株狂犬病毒与我国人用精制狂犬病疫苗CTN株系统发育关系较近。结论外观健康的家犬能够携带狂犬病毒;犬养殖量大、免疫率低以及狂犬病毒携带率高仍是当前我国狂犬病流行的主要原因。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

血液透析患者中TT病毒感染的检测及序列分析

目的：研究血液透析患中TT病毒（TTV）的感染状况及其致病性。方法：针对病毒基因保守区设计引物,采用套式PCR方法对69例血液透析患血清标本进行TTVDFNA检测及序列分析。并同时检测患血清丙氨酸转氨酶（ALT）及丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）。结果：患血清TTVDNA总阳性率为27.5%。对其中1例PCR扩增产物测序。结果与其他TVV分离株如GH1、TA278、TTVCHN1和TTVCHN2的核苷酸序列同源性为89%-100%,推测的氨基酸序列同源性为87%-100%。抗-HCV阳性与阴性患的TTV DNA阳性率无明显差异。所有患均未见ALT明显升高。结论：血液透析患存在较严重的TTV感染与HCV感染无明显相关性。未发现TTV感染导致ALT明显升高的证据。     

狂犬病毒融合基因pVax-G/N的克隆

目的构建狂犬病病毒G基因和N基因的融合表达载体,为研究融合基因疫苗打下基础。方法利用分子生物学技术从质粒pVax-G中克隆出狂犬病毒G和N基因,经连接及鉴定成功后与酿酒酵母表达载体pYes2连接,并进行酶切及测序鉴定。结果融合基因pVax-G/N测序结果与预期完全符合。结论成功构建了融合表达载体pYes2-pVax-G/N,为进一步研究稳定、安全的狂犬病疫苗奠定基础。     

Molecular characteristics and phylogenetic analysis of N gene of human derived rabies virus

Objective To investigate the relationship between the molecular characteristics and phylogenetic evolution of rabies N gene.Methods Saliva samples were collected from rabies cases,and RT-PCR was used to amplify the N gene of rabies virus with the specific primers.The amplifying product of RT-PCR was cloned to pUCm-T vector and transformed into E.coli XL1-Blue and then the blue-white selection,PCR screening and gene sequencing were carried out to identify the positive clones.Finally,ExPASy and other bioinfor...     

宁波市麻疹野毒株N基因片段研究

目的探讨宁波市麻疹流行株的基因型别和遗传特征。方法利用细胞培养从宁波市2004~2005年28例临床诊断麻疹病例的咽拭子中分离麻疹病毒,通过RT-PCR扩增出病毒核蛋白(N)基因C末端456bp片段进行测序,并分析其和GenBank中麻疹病毒各基因型代表株的同源性。结果分离到8株麻疹病毒,其N基因片段与H1型代表株Hunan.CHN的同源性为97.6%~98.5%,与麻苗Shanghai-191的同源性为92.8%~93.4%。结论宁波市麻疹流行株属于H1基因型。     

狂犬病165例临床分析

目的总结狂犬病临床特征及流行病学表现,提出相应的防治对策。方法对165例狂犬病患者个案进行流行学调查,并进行回顾性分析。结果患者以农民为主,占80%,男129例,女36例,年龄3～82岁,96%病例有典型狂犬病症状,99%患者中性粒细胞升高,78%血糖升高,潜伏期12d～20余年;从发病到死亡时间1～10d。88%患者未正确处理伤口,84.8%的患者暴露后未接种狂犬疫苗。结论联合抗病毒治疗并早期使用人工呼吸机辅助呼吸对延长患者生存期有一定意义,对患者暴露后及时正确伤口处理,按时、全程主动免疫联合被动免疫是降低发病率的重要措施。     

狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究

目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度(CCID50),并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法(direct immunofluorescent assay,dFA)做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 (PFU和CCID50)测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。     

狂犬病毒隐性感染者生存状况研究

目的:查明人群中是否真正存在狂犬病毒隐性感染者。方法:检测有暴露史的自愿者体内的狂犬病毒抗体、随访调查其生存状况和抗体的消长情况,并与狂犬病死亡者的一些情况进行比较分析。结果:有暴露史222例自愿者中检出隐性感染者45例,其中密切接触者23例,被咬伤者22例,其体内的狂犬病毒抗体逐年下降,2006年其检测阳性率为0;这些隐性感染者的感染期绝大部分已超过我市狂犬病患者的最长潜伏期。结论:我们检出的45例感染者是真正意义上的隐性感染,而非潜伏期内感染。     

狂犬病毒非临床型感染初探

目的：探讨狂犬病毒非临床型感染的可能性。方法：收集病例资料和检测暴露人群血清中的狂犬病毒抗体。结果：(1)收集到的2例患者，在被犬咬伤，愈后又复发不良反应，同时伴有血清中狂犬病毒抗体4倍增长的现象；(2)检测的暴露人群49例中(无疫苗接种史)，检出狂犬病毒抗体7例(14．28％)。结论：狂犬病毒可以引起非临床型感染即隐性感染(亚临床感染)。