汉坦病毒辽宁地区黑线姬鼠体内分离株的基因分型

目的 分离辽宁地区汉坦病毒，对分离株(SY13)进行基因分型，以弄清辽宁地区汉坦病毒流行株的基因型和基因亚型。方法 采用组织细胞培养法分离汉坦病毒：用RT—PCR法分别扩增SY13的M片段G1、G2区和S片段，通过DNAstar序列分析软件分别对三个基因片段的序列与从GenBank下载的序列进行同源性分析，并构建种系发生树。结果 通过对三个基因片段进行比较分析，SY13与HTN型同源性较高，为79．3％～97．0％；通过M片段G2区的比较分析，SY13与BA010、BA014、JIANG13、BA09、Q33处于同一分支，同源性达到95．0％～97．0％。结论 辽宁地区汉坦病毒分离株(SY13)与黑龙江地区分离株属同一亚型，为HTN型病毒中的H4亚型。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

安徽省阜阳市狂犬病街毒株G基因序列分析

目的了解安徽省阜阳市流行的狂犬病毒株与人用、兽用狂犬病疫苗株在G基因核苷酸和氨基酸水平的差异,为有效控制我国狂犬病疫情提供初步科学依据。方法在安徽省阜阳市收集犬脑组织162份,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和小鼠颅内接种试验（MIT）检测样品带毒情况,对阳性样品用RT—PCR扩增G基因并测序,以TOPALi和DNAStar软件对G基因序列进行分析。结果从安徽省阜阳市162份犬脑样品中检出阳性样品15份;这15株病毒与我国现在使用的各种疫苗株在G基因的核苷酸和氨基酸水平上均存在不同程度的变异,与我国人用疫苗株CTN同源性较高。结论15株狂犬病毒为基因Ⅰ型狂犬病毒,在核苷酸或氨基酸水平上,与疫苗株CTN之闻的同源性要高于与其它疫苗株之间的同源性。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析

 目的 分析河南省9株狂犬病毒的核蛋白基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性的可能变异。方法 以RT-nested-PCR扩增9株2006年12月分离于河南省信阳市的狂犬病毒街株,经纯化、克隆、测序后获得9条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析。结果 9株狂犬病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为97.5%~99.3%和98.4%~99.8%;病毒与CTN疫苗的核苷酸序列同源性最高,为88.9%~90.1%,氨基酸序列同源性为97.6%~98.0%;与其他疫苗株相比,9株病毒与其核苷酸及氨基酸同源性范围分别为84.4%~87.9%和94.2%~97.3%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代。结论 9株河南省狂犬病毒流行株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,这些变异可能影响疫苗对流行株所致狂犬病的保护效果。     

兰州羔羊轮状病毒株VP4基因稳定性及基因结构分析

目的了解兰州羔羊轮状病毒（LLR）株VP4基因遗传变异特点及与人源性轮状病毒基因结构上的相关性,为疫苗的质量控制和对人体的免疫原性提供理论依据。方法严格按疫苗生产过程将LLR疫苗株毒种LLR38代在新生牛肾原代细胞传至第49代,取LLR38、LLR43、LLR44、LLR49代进行研究。通过逆转录-聚合酶链式反应获得了LLR株传代病毒VP4全基因的cDNA片段,构建成重组质粒,经酶切筛选,对克隆的VP4基因进行序列测定。结果LLR株VP4基因全长2362bp,编码776个氨基酸。各代次病毒的核苷酸和氨基酸遗传稳定,核苷酸同源性在99．7％-100．0％,氨基酸同源性在99．0％-100．0％。不同P基因型来源轮状病毒在亲缘关系上没有明显的区分。氨基酸序列比对分析显示,LLR株与13株人源病毒在基因结构上密切相关。结论LLR疫苗株vP4基因具有很好的遗传稳定性,LLR株毒种及生产的疫苗是安全有效的,能够预防轮状病毒感染。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律。方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918~2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918~2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列。结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近。三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性。2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1 (DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1 (1918~2008年)病毒的赖氨酸不同。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源于2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

不同疫区家犬携带狂犬病毒的比较研究

目的比较河南和陕西两省外观健康的家犬狂犬病毒携带率,为加强当前犬只管理、控制我国狂犬病不断上升的疫情提供参考依据。方法调查河南和陕西两省近年来人间狂犬病疫情;分别采集河南和陕西两省外观健康的家犬脑组织样品121份和645份,以免疫荧光实验（IFA）、小鼠颅内接种试验（MIT）以及逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测样品带毒情况;以MEGA及DNAStar等生物信息学软件对病毒核蛋白基因进行分析。结果从河南省121份犬脑样品中栓出阳性结果9份,陕西省645份样品无阳性;9株狂犬病毒与我国人用精制狂犬病疫苗CTN株系统发育关系较近。结论外观健康的家犬能够携带狂犬病毒;犬养殖量大、免疫率低以及狂犬病毒携带率高仍是当前我国狂犬病流行的主要原因。     

Comparative Analysis of the Pathogenic Mechanisms of Street Rabies Virus Strains with Different Virulence Levels

Objective To characterize two strains of street rabies virus （RABV） isolated from the brain tissue of cattle from Inner Mongolia. Differences in the histopathological and ultrastructural changes in the brain tissue of infected mice were determired to reveal variation in the pathogenesis of infection between street rabies virus strains. Methods Ten-day-old mice were intracranially inoculated with one of three virus strains and brain tissue harvested when the mice were moribund. Various histopathological and ultrastructural markers of disease were then compared between the groups. Results Infection with the street virus strain CNMllO1C resulted in severe neuronal dendrites damage, but only mild cell apoptosis, T lymphocyte infiltration and microglial activation. Infection with the other street virus strain, CNMll03C, was characterized by cell apoptosis, T lymphocyte infiltration and microglial activation as well as dendrites damage. However, in comparison, infection with the attenuated virus strain CTN caused ~evere T lymphocyte infiltration, microglial activation and cell apoptosis, but left the neuronal dendrites intact. Conclusion The two street rabies virJs strains isolated from cattle from Inner Mongolia had different levels of virulence and caused distinct pathological changes in infected mice. Therefore, we concluded that different pathogenic mechanisms exist between different RABV strains.     

Molecular characteristics and phylogenetic analysis of N gene of human derived rabies virus

Objective To investigate the relationship between the molecular characteristics and phylogenetic evolution of rabies N gene.Methods Saliva samples were collected from rabies cases,and RT-PCR was used to amplify the N gene of rabies virus with the specific primers.The amplifying product of RT-PCR was cloned to pUCm-T vector and transformed into E.coli XL1-Blue and then the blue-white selection,PCR screening and gene sequencing were carried out to identify the positive clones.Finally,ExPASy and other bioinfor...     

狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究

目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度(CCID50),并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法(direct immunofluorescent assay,dFA)做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 (PFU和CCID50)测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区基因克隆和序列分析

本文应用聚合酶链反应技术获得了狂犬病毒ａＧ株糖蛋白膜外区基因克隆并进行了序列分析。测出其核苷酸序列与其他株相应区序列的同源性在９０．１２％到９３．０３％之间，推导氮基酸序列的同源性在９１．４１％到９３％、２３％之间，经分析发现成熟肽推导氨基酸第１８２位的替代，导致了乙酰胆碱受体结合序列的构象改变，可能是造成ＲＶａＧ毒力减弱的分子基础。     

德宏州2010年以来狂犬病流行态势分析

目的分析德宏州狂犬病流行态势,为制订防控措施提供科学依据。方法收集2010年1月-2011年6月全州狂犬病疫情资料,并进行统计分析。结果全州发生狂犬病2例;发现病犬10只,病犬咬伤居民43人、犬6只、黄牛1头;检验病犬脑组织3份、病牛脑组织1份,检出狂犬病毒4株;对犬伤者接种狂犬疫苗41份。疫情分布于4个县市8个乡镇9个自然村。结论德宏州狂犬病出现明显的上升趋势,需加强落实各项防治措施。     

Sylvatic rabies studies in the silver fox (Vulpes vulpes). Susceptibility and immune response

The trials reported here show that the fox is highly susceptible to rabies virus. Vaccination with ERA rabies vaccine was capable of protecting foxes against challenge with naturally occurring strains of sylvatic rabies.Oral immunization against rabies using ERA rabies vaccine was possible.