间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

逆转录聚合酶链反应检测恶性疟原虫的应用研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测恶性疟原虫的新方法,并用于检测现场采集血样。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,采用RT—PCR技术,恶性疟原虫预期被扩增出359bp特定扩增带。结果 从培养的恶性疟血样和现场采集的恶性疟血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。本检测系统初步显示可检出0．34个疟原虫／出血样,37份现场采集经镜检确诊的恶性疟血样中,36份RT—PCR检测为阳性,1份RT—PCR检测为阴性,阳性符合率为97．35％。结论 RT—PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的 建立鉴别人体四种疟原虫的套式PCR技术，检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法 选用两组疟原虫引物，扩增SSUrDNA特定片段，经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果 采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为104bp、102bp和115bp特异片段。所检测的138份疟疾患者血样中，四川名山县95份均为间日疟单纯感染，筠连县37份中10份为与间日疟和/或恶性疟呈混合感染的三日疟，云南金平县的6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论 所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点，在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立

目的建立可同时检测四种疟原虫的多重荧光定量PCR方法。方法 PCR扩增四种疟原虫目的片段,克隆并构建标准质粒,进行梯度稀释。体系按浓度加入五重引物探针,对临床四种疟原虫阳性血样及单一腺病毒和肺炎支原体阳性血样、人基因组进行特异性检测。将本地区优势虫种恶性疟及间日疟阳性血样混合并检测。每个反应做一式三份验证重复性。检测标准品梯度浓度,获得体系最低检测限。结果成功构建四种疟原虫标准质粒。对20份样本进行检测,其中15份恶性疟,3份间日疟,1份三日疟,1份卵形疟,与原有确证结果一致。对单一腺病毒及肺炎支原体阳性血样、人基因组检测结果均为阴性。恶性疟及间日疟阳性血样混合检测显示3条特异性扩增曲线。三个复孔的变异系数在0.17~4.96之间。恶性疟可检测到10~2copies/m L,间日疟、三日疟、卵形疟可检测到10~3copies/m L。结论建立五重荧光定量PCR检测四种疟原虫特异性及重复性均较好,灵敏度高,可用于疟原虫快速筛选及分型鉴定。     

不同检材微量血间日疟原虫PCR检测模板制备方法的研究

目的 探寻不同检材微量血间日疟原虫PRC检测模板制备的方法.方法 全血标本采用酚/氯仿抽提法、洗涤沉淀法、Chelex煮沸法和洗涤水煮法;滤纸干血滴及厚血膜标本以Chelex煮沸法和洗涤沉淀法制备模板.以间日疟原虫特异性引物作PCR扩增检测模板制备的效果.结果 采用上述4种不同的方法制备的全血间日疟原虫DNA模板与采用Chelex法和洗涤沉淀法制备的滤纸干血滴以及厚血膜疟原虫DNA模板均可被扩增出1条341bp的间日疟原虫特异性DNA条带,与预期的扩增片断大小一致;不同方法制备的10份间日疟患者血样DNA模板用于PCR扩增检测,结果无明显差异.其中,Chelex煮沸法和洗涤沉淀法对不同检材的疟原虫感染血样DNA模板均能有效制备,且可在同一离心管中进行,减少了交叉污染的机会.结论 Chelex法和洗涤沉淀法简便、实用,适用于不同检材微量血疟原虫PRC模板的制备.     

云南省1例输入性三日疟实验室检测分析

目的对云南省1例输入性疟疾患者的血样进行实验室检测分析。方法采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物对该样本进行巢式PCR检测,将PCR扩增结果进行序列测定,并对获得的序列进行Blast比对,分析其分子性状。结果使用疟原虫属特异性引物r PLU5和r PLU6对血样进行PCR检测,第一轮未扩增出预期条带;使用疟原虫种特异性引物对血样进行PCR检测,扩增出预期大小约141bp的三日疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和卵形疟扩增条带产生。序列分析表明,扩增片段长度为115bp,进行Blast比对发现,与Genbank中注册编号为gb|KJ934253.1的三日疟对应部分的基因序列同源性为96%。结论通过使用巢式PCR、序列测定分析等方法,基本证实该病例为三日疟原虫感染。     

SAG2基因片段的体外扩增及在孕妇弓形虫感染诊断中的应用

目的：根据弓形虫表面抗原SAG2基因序列，设计弓形虫特异性引物一对，采用聚合酶链反应技术，进行弓形虫感染的检测。结果：从弓形虫DNA提取物中扩增出593bp的基因片段，与预期的扩增片段大小相符;与弓形虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、间日疟原虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；该检测体系至少可检测出相当于每μl血样中2个弓形虫的水平；将该检测体系用于临床孕妇产前诊断，56份标本中检查出3例。结论：所建立弓形虫PCR检测体系灵敏、特异，适用于孕妇弓形虫感染的诊断。     

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的 建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v,)的双重聚合酶链反应(PCR)法。方法 根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f．与P．v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规。结果 从P.f.和P．v．感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1-5个虫／μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P．c,)与P.v．相似,在412bp可见扩增条带。经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f．109例、P.v.l114例、P．f. P.v.9例,阳性率67．4％;比常规镜检的阳性率66．3％稍高,尤以检出P．f． P．v．感染病例高。分别检测人工感染P.f．与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果。结论一次性检测P．f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点。对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值。     

重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价

目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术（RAA）检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA （18S rRNA）基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫( Plasmodium falciparum, P.f )、间日疟原虫( P. vivax, P.v)、三日疟原虫( P. malaria, P.m)、卵形疟原虫( P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫（婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫）,以评估该体系的灵敏度和特异度。 结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37 ℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10^-2 copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为10² copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。     

Nested polymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes

目的　检测蚊体内间日疟原虫DNA。方法　以疟原虫SSurRNA为模板 ,采用套式PCR扩增间日疟原虫特异性 12 1bp片段。结果　在实验感染蚊中 ,套式PCR可检测到低至 3个间日疟原虫子孢子的DNA或 10 0只蚊中的一只阳性蚊 ,而其它 3种人疟原虫或正常蚊DNA未扩增出条带。结论　套式PCR的敏感性及特异性表明 ,该方法在检测蚊体内少量疟原虫感染时 ,比DNA探针或直接PCR具有更大优越性。     

聚合酶链反应用于恶性疟疾诊断初步研究

合成一对恶性疟原虫特异引物，用聚合酶链的反应（PCR）技术检测海南岛恶性疟病人滤纸血滴30例，结果28例阳性，在206bp处可见一条清晰易辨的扩增条带，2例阴性经血片复查，其中1例为间日疟原虫；同时检测间日疟病人血滴和未发现原虫的发热病人血滴各16例，均为阴性，与镜检符合率达98．4％（61／62例）。初步表明PCR法具有准确、敏感、特异、简捷等优点，采用滤纸血滴方便现场采样、保存和送检，且易批量检测，在疟疾临床诊断和流行病学调查方面，将可替代血片镜检法，逐步扩大应用。     

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的 了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法 收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式 PCR 检测。结果 采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi 和变种型wallikeri 分别扩增出800 bp和780 bp目的 条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%（2/49）、12.2%（9/74）、8.2%（4/49）、11.4%（4/35）,卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检 结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论 分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR 检测,避免误诊。     

艾康恶性疟/间日疟免疫层析检测试剂盒效果评价

目的 评价艾康恶性疟／间日疟（P．f／P．v）胶体金免疫层析检测试剂盒诊断疟疾效果。方法 以镜检法为金标准。采用盲法实验室测试疟痰阳性和阴性血样。结果 共测试331例血样，其中疟痰血样121倒。对疟疾的灵敏性和特异性分别为92．56％和98．57％，与镜检符合率为96．38％；其中恶性疟的灵敏性和特异性分别为1130．00％和98．57％，重复性为100．00％；对间日疟的灵敏性和特异性分别为86．96％和100．00％，恶性疟和间日疟之间无交叉反应。结论 艾康P．f．／P．v肢体金免疫层析检测试剂盒诊断疟痰具有快速、简便、准确、直观以及不需要特殊仪器优点，能同时诊断单纯恶性疟和单纯间日疟，但不能鉴别诊断混合感染。     

无偿献血者乙型肝炎病毒核心抗体与隐匿性感染的关系

目的探讨无偿献血者乙型肝炎病毒核心抗体（anti．HBc）与隐匿性乙型肝炎病毒感染的关系。方法收集无偿献血者样本9100份,采用ELISA法进行HBsAg和anti—HBc血清学筛查,anti—HBc阳性血清再通过PCR检测乙肝病毒核酸（HBVDNA）。结果9100份无偿献血者标本中anti—HBc阳性911份（10．01％）,HBsAg阳性199份（2．19％）;911份anti—HBc阳性标本中,HBsAg阴性820份（90．01％）,HBVDNA阳性34份。结论如果常规筛查不检测anti—HBc,血液中HBVDNA将被漏检。无偿献血者血液中HBsAg阴性的情况下,仍然存在病毒传播的潜在风险,有必要重视无偿献血者初筛HBsAg阴性人群的进一步血清学检测。