HIV-1疫苗prime-boost策略免疫间隔研究

目的探索不同的DNA、重组痘苗病毒、蛋白疫苗免疫间隔在HIV-1疫苗prime-boost策略中对免疫效果的影响,为建立最佳免疫方案提供理论支持。方法对小鼠进行3针DNA初免,之后分别间隔3周、6周、12周、16周免疫重组痘苗病毒VTKgpe;对小鼠或兔子进行3针DNA初免,间隔16周免疫VTKgpe,之后分别间隔4周或8周免疫gp140蛋白。末次免疫后2周检测HIV-1特异性体液或细胞免疫应答。结果 DNA初免-VTKgpe加强间隔16周效果最佳,诱导的HIV-1 Env特异性抗体滴度达到105,分泌IFN-γ的T细胞数为5 966.4/106细胞。DNA初免,间隔16周VTKgpe加强,之后间隔4周或8周gp140蛋白加强效果差异无统计学意义。结论 DNA疫苗初免,16周后VTKgpe加强,4周后gp140蛋白加强可诱导较高的免疫应答,同时更为适宜临床试验及商业化应用的需要。     

CD137L在HBsAg DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫应答中的佐剂效应

目的:研究共刺激分子CD137L重组质粒对HBsAg DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫应答和回忆反应的佐剂作用.方法:将小鼠CD137L真核表达载体(pcD137L)体外转染NIH3T3细胞,RT-PCR、流式细胞仪和免疫荧光法分别检测CD137L mRNA和蛋白的表达;pcD137L与HBsAg DNA疫苗(pcDS)通过肌肉注射联合免疫BALB/c小鼠,LDH释放法测定体外脾细胞特异性CTL杀伤活性;流式细胞仪分析小鼠脾脏CD8+记忆T细胞数量;流式细胞仪检测CD8+T细胞及淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的表达水平.结果:重组质粒pcD137L在NIH3T3细胞中获得有效表达.与pcDS单独免疫组比较:免疫后1周,pcDS+pcD137L免疫组能诱导更强的HBsAg特异性CTL杀伤活性(P<0.05);免疫后1周和12周,pcDS+pcD137L免疫组CD8+T细胞CD44high和CD127表达水平均显著增高(P<0.05或P<0.01);免疫后1周、12周和13周(即再次给予pcDS刺激后1周),pcDS+pcD137L免疫组分别明显上调CD8+T细胞和淋巴细胞中IFN-γ产生细胞的百分比,差异有显著意义(均P<0.05).结论:共刺激分子CD137L能显著增强HBsAg DNA疫苗诱导的Tc1(I型)细胞免疫、特异性CTL应答及回忆反应,是诱导HBV特异性T细胞应答的有效佐剂.     

IL-12对乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

目的　观察编码鼠 IL - 12的真核表达载体对 HBVDNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,EL ISA法检测小鼠血清抗 HBs,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL杀伤活性 .结果　免疫 8wk后 ,单纯注射 p CR3.1- S及共注射 IL - 12真核表达载体的小鼠血清 45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15 .CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,两组均有明显差异 (P<0 .0 1) ,脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 CTL 细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) % ,(75 . 6±9.1) % ,抗 CD8+单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) % ,(16 .9± 2 .3) % .结论　 IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对 DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由 CD8+执行 .基因疫苗可能用于预防及治疗 HBV感染     

Epstein—Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

目的：探讨EBV－LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果。方法：将已构建的EBV LMP1基因（EBV LMP1）重组质粒pcDNA3－BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBV LMP1抗体滴度、CD4^ /CD8^ T淋巴 细胞亚群的数量变化以及EBV LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照。结果：重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBV LMP1抗体;其脾细胞中CD4^ /CD8^ T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBV LMP1特异性的CTL存在。以上结果在免疫16周之内无明显改变。结论：EBV－LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株DNA疫苗 在小鼠体内的免疫反应

:【目的】探讨恶性疟原虫DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应。【方法】将恶性疟原虫FCC 1/HN株重组质粒pcDNA3 Pfs2 5及 pcDNA3 EBA175 /HRPⅡ经骨骼肌途径分别单独注射或两者混合注射免疫BALB/c小鼠 ,观察免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4 /CD8 T细胞亚群比值和NK细胞杀伤活性的变化。【结果】pcD NA3 EBA175 /HRPⅡ与 pcDNA3 Pfs2 5分别单独肌肉注射或两者混合肌肉注射免疫小鼠后 ,均可见血清IgG抗体滴度增高 ;针对恶性疟原虫抗原的特异性T淋巴细胞增殖反应增强 ;CD4 /CD8 T细胞比率下降以及NK细胞杀伤活性增强。【结论】提示肌肉注射为一有效的DNA疫苗免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫有性期阶段或无性红细胞阶段的重组质粒单独或两者混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫反应和NK细胞杀伤活性。     

Epstein-Barr病毒LMP1 DNA免疫小鼠免疫效果的测定

[目的]探讨EBV-LMP1重组体DNA免疫小鼠后的免疫效果.[方法]将已构建的EBVLMP1基因(EBVLMP1)重组质粒pcDNA3-BLMP1肌肉注射免疫Balb/c小鼠,在免疫后的不同时间分别用ELISA、流式细胞仪及LDH法检测免疫小鼠体内特异性EBVLMP1抗体滴度、CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群的数量变化以及EBVLMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性.用pcDNA3质粒及PBS作为阴性对照及空白对照.[结果]重组质粒免疫Balb/c小鼠后,可在外周血液血清中检测到特异性的EBVLMP1抗体;其脾细胞中CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数量明显高于阴性对照及空白对照,且可检测到EBVLMP1特异性的CTL存在.以上结果在免疫16周之内无明显改变.[结论]EBV-LMP1质粒重组体可刺激小鼠产生特异性的体液和细胞免疫,并且可维持一定的时间,具有较好的免疫原性,是一种有效、制备方便的EBV候选疫苗.     

HER2/neu诱导DBA/2小鼠特异性CTL应答及其抑瘤效应研究

目的：探讨HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫诱导特异性细胞免疫应答及其在体内的抑瘤效应。方法：将重组HER2/neu原癌基因真核表达载全转染P815细胞，用细胞组织化学及Western-blot方法鉴定质粒在细胞中的表达。在DBA/2小鼠体内构建表达HER2抗原的肿瘤动物模型，通过重组质粒免疫小鼠，诱导小鼠产生细胞免疫应答，观察免疫动物体内的抗瘤效应。结果：在体外获得了稳定表达HER2/neu基因的P815细胞；免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL，并杀伤HER2/neu阳性的P815细胞；荷瘤小鼠的肿瘤生长受抑，存活期延长。结论：HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答，并具有一定抗瘤效应。     

截短型肿瘤抗原BAP31 DNA疫苗的构建及免疫效果分析

目的：通过LAMP分子的靶向作用,增强截短型BAP31肿瘤抗原（BAP31）的MHC-Ⅱ提呈,激活更多的特异性CD^4＋T细胞,最终辅助增加CTL细胞的杀伤活性及特异性抗体产生。方法：构建重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31,同时构建重组质粒P-△AP31／EGFP和P-L△AP31／EGFP。质粒P-△AP31／EGFP和P-L△AP31／EGFP瞬时转染Hela细胞,荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31免疫C57BL／6小鼠,间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;ELISPOT检测免疫脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率;乳酸脱氢酶释放法检测免疫小鼠特异性CTL反应。结果：经酶切鉴定及序列测定,成功构建截短型肿瘤抗原BAP31的DNA疫苗重组载体;用带EGFP报告基因的重组质粒转染Hela细胞,荧光显微镜观察可见特异性的绿色荧光;ELISA检测免疫小鼠血清,带LAMP组BAP31特异性抗体效价明显高于不带LAMP组（P〈0.01）,且两者均高于空质粒及正常对照组;ELISPOT检测分泌IFN-γ,IL-4的T细胞频率,带LAMP组明显增高（P〈0.01）;杀伤试验表明,特异性CTL活性带LAMP组较不带LAMP组显著提高,且均高于对照组（P〈0.01）。结论：构建的P-△AP31和P-L-△AP31基因疫苗不仅在小鼠体内均可诱导特异性体液和细胞免疫应答,而且P-L-△AP31基因疫苗的免疫效果显著优于P-△AP31,为进一步研制肿瘤治疗性基因疫苗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒核心区DNA疫苗接种后H-2d小鼠的特异性免疫应答

目的　观察乙型肝炎病毒 (HBV)核心区DNA疫苗接种后BALB/c(H 2 d)小鼠的特异性免疫应答。方法　构建HBV核心区DNA疫苗 (PJW430 3/HBc) ;用基因枪法和肌内注射法将该DNA疫苗接种BALB/c小鼠 ;ELISA法检测小鼠血清抗 HBc(IgG)及IgG亚类 (IgG1,IgG2a) ;51铬释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性。结果　该DNA疫苗在体外转染细胞中可良好表达HBcAg。血清抗 HBc终点滴度在DNA疫苗基因枪组和肌肉注射接种组小鼠分别为 1∶32 80 5 0和 1∶10 935 0。两组小鼠的抗 HBcIgG亚型均以IgG2a略占优势。两组小鼠的HBbAg特异性CTL杀伤活性分别达到 5 1 1%和 5 5 2 %。结论　HBV核心区DNA疫苗在小鼠实验中具有良好的细胞免疫和体液免疫原性。     

MUC1基因疫苗和GM-CSF对小鼠的细胞免疫和体液免疫应答

目的:观察MUC1基因疫苗和GM-CSF共免疫对小鼠特异性细胞免疫和抗体水平的影响.方法:采用股四头肌肌肉注射,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫雌性Balb/c小鼠,每3 wk 1次,共3次.MUC1基因加GM-CSF组于每次基因免疫后1,3,5 d,皮下注射GM-CSF 100 μL.最后1次基因免疫后第3周接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞.2 wk后观察、记录肿瘤的生长情况.流式细胞仪检测外周血CD4 和CD8 淋巴细胞亚群的百分比和比值.ELISA方法检测小鼠血清MUC1特异性抗体的水平.4 h 51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性.结果:淋巴细胞亚群:与pcDNA3.1对照组相比,MUC1基因疫苗预防组的CD8 T淋巴细胞升高,差异有统计学意义(P《0.01),CD4 T淋巴细胞升高,差别无统计学意义;加GM-CSF佐剂预防组与单独MUC1疫苗预防组相比,CD4 T淋巴细胞升高,差异有统计学意义(P《0.01),CD8 T淋巴细胞升高差别无统计学意义.小鼠血清MUC1抗体水平:与对照组相比,MUC1基因疫苗预防组抗体水平升高,差异有统计学意义(P《0.05);加佐剂组与预防组相比,抗体水平升高但差别无统计学意义.在不同效靶比时, MUC1基因疫苗加GM-CSF组与单独MUC1基因免疫组相比较,特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率差异显著(P《0.05).结论:MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CD8 T淋巴细胞及体液免疫应答, GM-CSF对小鼠CD4 T淋巴细胞具有一定的调节作用.     

异种黑色素瘤相关抗原诱发抗肿瘤免疫伴发自身免疫性损伤

目的探讨腺病毒载体(Ad)介导异种黑色素瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)诱发抗肿瘤免疫与自身免疫性损伤的关系。方法用Ad编码的人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)皮内免疫C57BL/6小鼠,将小鼠分为正常对照组(d1703)、AdhTRP2和AdmTRP2免疫组。体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤试验和细胞内干扰素γ(IFNγ)染色(ICS)分析CTL杀伤活性和IFN-γ的产生(每组3只小鼠);皮下接种B16.F10黑色素瘤细胞(每组10只小鼠),观察荷瘤小鼠成活情况。结果AdhTRP2诱发小鼠CTL杀伤活性与免疫时间相关,免疫后1周活性达到最大,随后逐渐降低;AdhTRP2诱导的CTL杀伤活性具有剂量效应关系。AdhTRP2免疫小鼠1周其6hCTL杀伤率为94%±5%,脾脏产生IFNγ的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的0.87%±0.12%,而相应地AdmTRP2分别为22%±8%和0.15%±0.05%。接种1×106B16.F10细胞,AdhTRP2免疫的小鼠观察3个月100%无瘤生长,但在病毒注射部位有白癜风形成;而接种1×105B16.F10细胞的AdmTRP2免疫小鼠3个月只有20%的成活率,并不伴局部白癜风形成。结论用Ad介导异种TRP2能有效地打破对自身TRP2的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,同时伴发自身免疫性损伤。     

重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠IL-12基因质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法：将携带绿色荧光蛋白（GFP）基因质粒（pUV15）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB／c小鼠后2周，处死小鼠，观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布；将携带GLS和IL-12质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，第1次免疫后4周，处死小鼠，用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达，用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果：在BALB／c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布，以及GLS的表达，并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生。结论：携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布；携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后，可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫，以及GLS和IL-12的体内表达，为新型疫苗的研究奠定了基础.     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

IFN-γ与HIV-1gp120融合蛋白的表达及其免疫调节作用

目的：研究gamma干扰素（IFN-γ）对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）gp120蛋白免疫小鼠后效果的调节作用。方法：利用分子生物学技术，构建表达中国流行株HIV-1gp120N端片段基因的原核质粒pet44b-gp120，及共表达HIV-1gp120N端片段基因与IFN-γ基因的原核质粒pet44b-gp120／IFN-γ，在E．coli BL21（DE3）细胞中进行低温诱导蛋白表达，然后经纯化后免疫BALB／c小鼠。实验设皮下注射gp120／IFN-γ组、gp120组和PBS三组，以检测HIV-1gp120诱导的T细胞增殖能力，CTL杀伤作用以及Th1型细胞因子（IL-2，IFN-γ）和Th2型细胞因子（IL-4，IL-10）的表达情况。结果：通过PAGE和Western blot检测，证实上述两种蛋白在DE3细胞中得到表达。免疫学实验表明，针对HIV-1gp120的特异性T淋巴细胞增殖作用、特异性CTL杀伤作用，以及Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ表达在三组之间均有显著性差异（P〈0．05），gp120／IFN-γ组高于gp120组，gp120组高于PBS组（P〈0．05）。反映体液免疫反应的Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达在三组之间没有显著性差异（P〉0．05）。结论：协同应用IFN-γ基因可明显加强HIV-1gp120基因的细胞免疫反应。     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.     

BALB/c小鼠腹腔接种HBV表面S抗原疫苗引起的CTL反应

目的研究BALB/c小鼠免疫接种HBV表面S抗原疫苗(HBV small surface vaccine, S-HBsAg)能否引起特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。方法分别给BALB/c小鼠腹腔内接种0~6 μg S-HBsAg,两周后加强一次,4周后分离小鼠脾细胞,体外用S-HBsAg特异性CTL表位多肽刺激;用特异性多肽、51Cr标记的P815细胞作为靶细胞;4 h51Cr释放实验检测CTL反应。结果分别接种0、0.65、1.25、2.5、5μg S-HBsAg的小鼠,其脾淋巴细胞CTL特异性释放率分别为31.21%±9.23%、42.36%±19.32%、91.21%±22.97%、69.25%±24.13%、51.49%±21.661%;只接受一次免疫接种的小鼠,其脾淋巴细胞CTL特异性释放率分别为27.34%±14.25%、32.27%±15.35%、56.28%±24.35%、44.34%±18.65%、40.76%±56%。结论BALB/c(H-2d)小鼠腹腔内接种S-HBsAg引起剂量依赖性特异性CTL反应,加强免疫能够提高CTL反应。     

BALB／c小鼠腹腔接种HBV表面S抗原疫苗引起的CTL反应

OBJECTIVE: To observe cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses induced by immunization of mice with hepatis B small surface antigen (S-HBsAg). METHODS: BALB/c(H-2d) mice were injected intraperitoneally with S-HBsAg at the doses ranging from 0-5 microg with a booster injection 2 weeks later. Four weeks after the booster immunization, the specific cytotoxic reactivity of the spleen lymphocytes isolated from the immunized mice, following stimulation by S-HBsAg specific CTL epitope peptide in vitro, with 51Cr-labeled P815 cells treated with the peptide was observed. RESULTS: The percentage of specific release of 51Cr in mice immunized with S-HBsAg at the doses of 0, 0.65, 1.25, 2.5, and 5 microg was 31.21%+/-9.23%, 42.36%+/-19.32%, 91.21%+/-22.97%, 69.25%+/-24.13% and 51.49%+/-21.661% respectively. In mice receiving the only primary vaccination, the corresponding percentage was 27.34%+/-14.25%, 32.27%+/-15.35%, 56.28%+/-24.35%, 44.34%+/-18.65% and 40.76+/-56% respectively. CONCLUSION: Immunization with S-HBsAg efficiently elicits CTL response in BALB/c mice in a dose-dependent manner and enhanced by booster immunization.     

乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察

目的 观察不同品系小鼠（Ｈ－２＾ｂ,Ｈ－２＾ｄ）经乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）基因疫苗免疫后特异性辅助性Ｔ细胞反应类型和特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法鉴定该基因疫苗的体外表达产物;基因枪法和肌内注射法接种该基因疫苗;间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）水平;＾５１铬释放法测定小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。结果     

绵羊李斯特菌为载体的结核多阶段T细胞表位疫苗的构建及评价

  目的  构建以绵羊李斯特菌（Listerria ivanovii,LI）为载体的表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果。  方法  将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞表位串联形成融合抗原基因,即多阶段结核杆菌抗原基因,命名为msv。将msv插入含有LI同源序列的打靶质粒,利用同源重组技术构建基因组整合msv抗原基因的重组LI菌株。观察重组菌株的体外生长情况,通过Western blot验证靶抗原蛋白的表达情况,测定重组菌株对C57BL/6小鼠的半数致死量（50% lethal dose,LD₅₀）,以0.1×LD₅₀为免疫剂量,通过尾静脉接种小鼠,通过接种前及接种后1、2、3、5、7、14 d的血清谷丙转氨酶（ALT）水平、脏器载菌量和脏器病理切片评价疫苗候选株的安全性。为测定疫苗候选株的免疫效果,另取3组小鼠分别尾静脉免疫LI-msv、LI、NS,免疫后第9天制备脾悬液,流式细胞术检测分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞水平。  结果  成功构建能表达多阶段结核杆菌抗原的疫苗候选株LI-msv。LI-msv 对C57BL/6小鼠的LD₅₀为3.3×108 CFU/只。通过尾静脉接种小鼠后,LI-msv主要在小鼠肝脏和脾脏内短期繁殖,7 d后能被机体清除,对肝、脾的病理损伤时间短且可恢复;流式细胞术检测结果表明接种LI-msv的小鼠脾淋巴细胞分化出了特异的IFN-γ+ CD4+ T细胞和IFN-γ+ CD8+ T细胞,阳性细胞比率较相应载体对照组和生理盐水对照组高（P<0.005）;特异性TNF-α+ CD4+ T细胞比率高于相应载体对照组（P<0.01）和生理盐水对照组（P<0.005）,TNF-α+ CD8+ T细胞比率高于生理盐水对照组（P<0.005）。  结论  成功构建了一株以LI为载体的表达结核杆菌多阶段抗原的疫苗候选株。该菌株具有生物安全性,且能诱导一定的特异性细胞免疫应答,有望作为结核疫苗候选株进行深入研究。