日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚基的序列分析

目的 发现并克隆日本血吸虫新基因。方法 对已获得的日本血吸虫表达序列标签(EST)进行同源性分析。识别血吸虫新基因；根据EST设计引物，用3′RACE从mRNA中扩增获得新基因全长，用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能分析，将新基因的完整编码阅读框克隆入原核表达载体pGEX一4T—1。结果 用3′RACE获得一个EST的3′端所缺序列，得到完整编码阅读框，其开放阅读框((ORF)654bp，编码217个氨基酸。利用生物信息学技术确定其为日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定，证明日本血吸虫CKⅡβ原核表达质粒构建成功。结论 扩增并成功克隆日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位编码基因的全长cDNA。为进一步的功能研究打下基础。     

日本血吸虫微管蛋白基因的分离和cDNA序列分析

目的 分离和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行引物步移法测序，获取其全长cDNA序列；采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果获得了1个日本血吸虫新基因—微管蛋白基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子量为7．2198KDa，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论 获得了日本血吸虫微管蛋白基因的全长cDNA序列，为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

微小隐孢子虫腺苷酸激酶基因克隆及分析

目的获得微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,Cp)南京(NJ)株的腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)基因的核苷酸和氨基酸序列,比对分析与其他隐孢子虫株AK基因序列的差异。方法采用昆明种小鼠建立微小隐孢子虫NJ株感染模型,根据GenBank微小隐孢子虫Iowa II株AK基因已知序列设计合成2对引物,应用巢式PCR方法从微小隐孢子虫NJ株基因组DNA中扩增AK基因,并将其克隆入pMD18-T载体;对重组质粒pMD18-T-CpAK经PCR及酶切鉴定后测序,应用生物信息学方法分析微小隐孢子虫NJ株AK基因与其他虫株的核苷酸和氨基酸序列差异。结果巢式PCR扩增获得特异的AK基因序列,酶切及PCR鉴定为正确的pMD18-T-CpAK重组质粒,扩增序列为903bp,含隐孢子虫AK全长基因663 bp;核苷酸序列测定及同源性分析表明,微小隐孢子虫NJ株AK基因与人隐孢子虫TU502 type 2株AK的同源性为99%,与微小隐孢子虫Iowa II株AK序列同源性为98%;进化树分析表明,微小隐孢子虫NJ株的AK基因与人隐孢子虫TU502 type 2株AK基因亲缘关系最近。结论成...     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆及序列分析

[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease of periodic Brugia malayi,BmCP）基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础.[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP基因序列,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌（E. coli）DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增签定,获得阳性重组质粒pMD18-T-BmCP,经测序验证,并进行同源性比较.[结果]RT-PCR扩增出一条约1 201 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.[结论]成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件.     

人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统序列分析

目的 对人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建及序列分析。方法 采用RT-PCR方法将肺组织中提取总RNA扩增人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列，将其插入到真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建重组表达质粒，并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果 入谷胱甘肽硫转移酶M1克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，测序结果同Genbank GSTM1(GI：183668)cDNA序列相比较，在619位点C→A，氨基酸由Pro→Thr；在519位点C→G，编码的氨基酸仍为1ys；在528位点C→T，编码的氨基波仍为Asp。同源性为99％，基因登陆号为AY532926。结论 入谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建，为进一步进行真核细胞和动物的解毒机制研究，提供应用材料。     

周期型马来丝虫GAPDH部分编码基因原核及真核表达载体的构建

[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础。[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmGAPDH,经测序验证,并进行同源性比较。亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。[结果]RT-PCR扩增出一条约877 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的一致。[结论]成功构建了周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶部分编码基因原核及真核表达载体,为进一步功能研究提供了条件。     

应用RT-PCR构建人表皮生长因子基因真核表达质粒

目的体外克隆及构建带信号肽的人表皮生长因子(hEGF)基因真核表达质粒。方法设计人表皮生长因子(hEGF)基因和信号肽基因引物,采用RT-PCR技术从胎肾组织总RNA中扩增出hEGF基因和信号肽基因序列,克隆入pGEM-T载体,酶切鉴定和序列分析后经T4连接酶连接并克隆入表达质粒pcDNA3.1( ),再次酶切鉴定和序列分析。结果RT-PCR扩增产物电泳获得约90 bp和180 bp条带,与hEGF及其信号肽cDNA大小符合;克隆入T载体后经序列分析与hEGF及信号肽基因一致,克隆入pcDNA3.1( )质粒后双酶切获得约230 bp和5.4 kb条带,再次测序与hEGF cDNA一致。结论成功构建带信号肽的hEGF基因的真核表达质粒。     

日本血吸虫组织蛋白酶L家族1个新基因的克隆与序列分析

目的克隆与分析日本血吸虫组织蛋白酶L样(SjCLs)基因全长cDNA序列,为进一步研究其功能奠定基础。方法提取日本血吸虫成虫总RNA,经RT-PCR扩增获得cDNA序列;将目的片段连接至pMD18-T Simple载体上,连接产物转化大肠埃希菌,通过酶切和测序鉴定重组质粒;利用生物信息学软件分析序列的开放阅读框、蛋白序列的同源率和功能区。结果以成虫总RNA为模板进行RT-PCR,得到一段长为996 bp的cDNA片段,该片段含有完整读码框,该阅读框编码的蛋白含有331个氨基酸残基,分子量为38.3 kDa,命名为SjCLs;序列比对分析发现该蛋白氨基酸序列与SjCL2同源率最高,达到89.1%;进化树分析发现SjCLs与SjCL2亲缘关系也最近;SjCLs具有类似于SjCL2的N端信号肽,可能经加工后分泌到细胞外;两者所预测的功能基序及三维构象也基本相同。结论 SjCLs具有组织蛋白酶L的基本特征,从而证明研究获得组织蛋白酶L基因家族的一个新成员。     

白色念珠菌hsp60基因克隆

目的:克隆白色念珠菌hsp60基因。方法:通过RT-PCR技术扩增白色念珠菌hsp60基因片段,纯化后与pMD18-T载体连接,转化并通过Amp、x-Gal、IPTG进行蓝白筛选,白色克隆提取质粒,SacⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,基因测序。结果:RT-PCR扩增得到1701bp片断,重组质粒pMD18-T-hsp60双酶切后在2692bp和1701bp处可见到酶切片段,测序结果与GenBank中白色念珠菌hsp60基因比较,同原性达99%。结论:成功克隆白色念珠菌hsp60基因,为进一步研究其免疫保护机制及制备白色念珠菌疫苗奠定基础。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonlcum，Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的诊断或防治提供靶抗原。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个新基因，其cDNA全长1251bp(AY225190)，编码331个氨基酸，编码蛋白与人类或螈、蟾蜍、鸡、鼠及猪等其它生物的乳酸脱氢酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的cDNA全长序列。     

pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的研究

目的:利用RT-PCR法从A组轮状病毒扩增基因片段VP7,再将产物重组于大肠杆菌pMD18-T载体,探讨pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的应用。方法:提取A组轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化和回收,最后把纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定。结果:成功将VP7基因连接到pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段),经DNA测序鉴定正确。结论:成构建功A组轮状病毒外壳蛋白VP7基因克隆载体,为进一步获得大量VP7基因以及研究和开发轮状病毒基因工程疫苗奠定基础。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中．通过RT—PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3．1^（＋）或pcDNA3．1^（-）真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363 bp相符;重组pGEM—T被EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3．1^（＋）和pcDNA3．1^（-）测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。