外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

转录因子Snail介导E-cadherin表达在食管鳞癌迁移和侵袭中的作用

目的探索转录因子Snail、E-cadherin基因在食管鳞癌中的表达及临床病理意义,明确其对食管鳞癌迁移和侵袭的影响。方法食管鳞癌组织及对应癌旁组织标本30例,PCR检测Snail、E-cadherin表达;以癌/癌旁组织相对表达量表示Snail及E-cadherin在mRNA水平表达的差异,分析其与临床病理特征间关系;随机抽取其中4例,Western blot检测Snail、E-cadherin表达。筛选三株食管鳞癌细胞株中的一株进行转染,利用Snail小干扰RNA作为实验组,以双链无义RNA转染作为对照组,检测Snail和E-cadherin表达水平变化,行细胞划痕、侵袭实验。结果 30例食管鳞癌组织较癌旁组织中Snail相对表达量高(1.96±0.75/0.52±0.43,P=0.04),E-cadherin相对表达量低(0.66±0.31/2.19±0.62,P=0.02);食管鳞癌中Snail相对高表达、E-cadherin相对低表达程度均与癌组织浸润深度(P=0.009)、淋巴结转移与否(P=0.047)相关。其中4例病人,癌组织相比对应癌旁组织中Snail蛋白表达高(0.73±0.13/0.23±0.08,P=0.00),而E-cadherin蛋白表达低(0.10±0.06/0.60±0.14,P=0.00)。选取EC109为实验细胞株,PCR结果显示,Snail小干扰RNA转染组较对照组中Snail表达减少(0.53±0.05/1.00±0.15,P=0.00),同时,E-cadherin表达上调(3.28±0.26/1.00±0.18,P=0.00);Western blot检测显示,抑制Snail蛋白表达后(0.25±0.05/0.41±0.10,P=0.03)EC109中E-cadherin蛋白表达上调(0.83±0.11/0.29±0.05,P=0.02)。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验示,下调Snail表达后EC109迁移、侵袭能力均减弱(P0.05)。结论转录因子Snail在食管鳞癌中相对高表达,并可能通过介导E-cadherin表达影响肿瘤迁移与侵袭。     

盐酸戊乙奎醚调控长基因间非蛋白编码RNA 00982对Eca-109食管癌细胞生物学行为的影响

目的探讨盐酸戊乙奎醚(PHC)对Eca-109食管癌细胞生物学行为的影响。方法分别给予0.01、0.05、1.00 μmol/L剂量的PHC处理人Eca-109食管癌细胞, 采用细胞计数试剂8(CCK-8)法、平板克隆形成实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、克隆形成及细胞凋亡率;使用划痕实验和Transwell迁移分析实验分别检测细胞迁移和侵袭能力;采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测长基因间非蛋白编码RNA 00982(LINC00982)表达量。pcDNA、pcDNA-LINC00982分别转染至Eca-109细胞, si-NC、si-LINC00982分别转染至Eca-109细胞后分别加入0.01、0.05、1.00 μmol/L PHC处理24 h, 采用上述方法分别检测细胞增殖、克隆形成数目、细胞凋亡率、迁移及侵袭能力;蛋白质印迹法(Western blot)检测E-钙黏素、B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)和N-钙黏素蛋白表达量。采用独立样本t检验和单因素方差分析。结果 PHC低、中和高剂量组Eca-109细胞增殖抑制率[(12...     

黏蛋白1在食管鳞癌上皮细胞-间质细胞转化过程中的作用

目的 观察黏蛋白1(MUC1)对食管鳞癌细胞生物学行为的影响并探讨其在上皮细胞-间质细胞转化过程中的作用.方法 设计构建靶向MUC1基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体pGC-LV-MUC1小干扰RNA(siRNA)并感染人食管癌细胞株Eca109,检测其对MUC1表达的抑制作用;应用噻唑蓝(MTT)与Transwell侵袭实验检测抑制MUC1对肿瘤细胞增殖、侵袭能力的影响,并采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)与Western blot检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)在各组细胞中的表达差异.结果 与对照组比较,感染pGC-LV-MUC1 siRNA后,Eca109细胞内MUC1基因水平(1.000±0.061比0.612±0.019)和蛋白水平(11.230±1.120比7.440±0.970)明显降低(P＜0.05);感染pGC-LV-MUC1 siRNA能显著抑制Eca109细胞的增殖活性,48 h (0.393±0.028比0.281 ±0.020),72 h(0.792±0.052比0.463 ±0.028,P＜ 0.05);感染pGC-LV-MUC1 siRNA后,Eca109细胞的侵袭数量也明显降低[(87±4)个比(48±7)个,P＜0.05];而Eca109细胞内E-cadherin基因水平(1.000±0.072比2.510±0.767)和蛋白水平(0.070±0.020比0.130±0.030)明显增高(P＜0.05).结论 MUC1可能通过诱导上皮细胞-间质细胞转化(EMT)而促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭.     

血管内皮生长因子反义RNA对EC9706人食管癌细胞抑制的作用

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)反义RNA对EC9706人食管癌细胞的抑制作用.方法 用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染至EC9706人食管癌细胞,用噻唑蓝还原法(MTT法)检测EC9706细胞增殖,免疫组化SABC和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测VEGF蛋白和VEGF mRNA表达水平.流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布.并将转基因EC9706细胞接种于BALB/C裸鼠后肢皮下,4周后观察皮下成瘤情况.结果 被反义VEGFcDNA质粒转染的EC9706食管癌细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,该细胞VEGF mRNA及蛋白的表达水平降低,但细胞生长增殖能力和增殖周期无明显改变,未发生明显凋亡现象;接种裸鼠28 d后,EC9706-wt组、EC9706-A组及EC9706-E组皮下移植瘤的潜伏期分别为(5.8±2.4)、(12.4±3.6)、(5.3±2.2)d,瘤体重量分别为(2.83 ±0.32)、(0.87±0.14)、(2.62 ±0.68)g,EC9706-A组与其他两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 VEGF反义RNA可抑制EC9706食管癌细胞VEGF表达和裸鼠体内肿瘤生长.     

小分子干扰RNA沉默人结直肠癌HT-29细胞TCF21基因对Kiss-1基因表达的影响

目的 观察小于扰RNA(siRNA)沉默结直肠癌HT-29细胞TCF21基因对Kiss-1基因表达的影响,以及细胞增殖、侵袭及迁移能力等生物学行为的变化.方法 利用脂质体lipofectamineTM 2000将siRNA稳定转染结直肠癌HT-29细胞,实验分为干扰组、阴性对照组、空白对照组;应用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)与Western blot技术检测TCF21与Kiss-1基因mRNA与蛋白的表达水平,分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和Transwell小室法检测干扰前后细胞增殖、侵袭与迁移能力的变化.结果 siRNA干扰后成功沉默了HT-29细胞TCF21基因的表达,Kiss-1基因mRNA的表达量为0.58 ±0.02,较对照组的1.00±0.00明显降低(P＜0.05),蛋白表达量为0.3491±0.0009,与对照组比较(0.8485 ±0.0016)亦出现明显下降(P＜0.05),同时细胞增殖、侵袭及迁移能力均明显增强(P＜0.01).结论 沉默TCF21基因的表达可以下调结直肠癌细胞Kiss-1基因的表达水平,并导致相应生物学行为的变化,因此TC F21基因可能是Kiss-1基因的上游调控因子.     

抑制热休克蛋白70表达对Eca-109细胞生长的影响

目的：观察热休克蛋白70（HSP 70）反义寡核苷酸阻断食管癌Eca-109细胞的HSP 70表达及对细胞增殖和凋亡的影响。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测HSP 70反义寡核苷酸(10μmol/L)转染Eca-109细胞后, 其HSP 70基因mRNA和蛋白表达的变化。观察HSP 70反义寡核苷酸转染对肿瘤细胞的生长抑制效应及转染后细胞凋亡率和细胞周期分布的改变。结果：HSP 70反义寡核苷酸可阻断Eca-109细胞HSP 70 mRNA和蛋白的表达;转染后48h和72h，生长抑制率分别为25.5%和35.4%;HSP 70反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于HSP 70正义寡核苷酸组和未转染组（P<0.05）。结论： HSP 70反义寡核苷酸能抑制Eca-109细胞的生长并诱导其发生凋亡。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.001,P＜0.001).体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关(P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005).结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

环状RNA 0004390对食管鳞状细胞癌增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

目的:探讨环状RNA 0004390(CircRNA_0004390)在食管鳞状细胞癌中的表达及对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法:选择50例食管鳞癌细胞患者为研究对象。食管鳞状细胞癌和人正常食管上皮细胞购自美国典型培养物保藏中心。构建CircRNA_0004390-shRNA沉默载体转染至ECA-109食管鳞状...     

RNA干扰抑制KATO-Ⅲ CD133阳性胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响

目的 探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增殖、侵袭、克隆球形成及化疗药物敏感性的影响.方法 通过免疫磁珠分选KATO-Ⅲ胃癌细胞中的CD133阳性细胞,将合成的CD133小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染至KATO-ⅢCD133阳性胃癌细胞内,使用荧光标记的siRNA （FAM-siRNA）检测转染效率,通过RT-PCR、Western-blot方法检测CD133基因表达的沉默效果及上皮-间质转化（EMT）相关因子（E-cadherin、Snail和N-cadherin）的蛋白表达,采用CCK-8、Transwell侵袭实验、单克隆球形成实验和CCK- 8等方法分别检测细胞增殖、侵袭、克隆球形成能力及对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性.结果 转染24 h后,转染效率可达到（87.7±8.1）％.干扰组CD133 mRNA及蛋白的表达显著低于阴性对照组（P＜0.01）.转染24、48和72 h后,与阴性对照组比较,干扰组细胞的增殖活性均得到显著抑制,差异均有统计学意义（P＜0.01）;转染72 h,干扰组细胞的增殖活性较阴性对照组降低了（52.1±8.0）％.与阴性对照组比较,干扰组的细胞侵袭数减少[（41.7±6.0）比 （130.3±11.0）,P＜0.05],克隆球形成率降低[（24.3±4.3）％比（45.1±6.4）％,P＜0.01],Snail和N- cadherin蛋白表达降低（P＜0.01）,而E-cadherin蛋白表达增高（P＜0.01）.干扰组细胞对化疗药物5-FU的敏感性显著增强,5-FU对干扰组细胞的抑制率为（62.4±3.3）％,较阴性对照组的（21.5±2.2）％增加（P＜0.01）.结论 CD133基因在胃癌细胞的增殖、侵袭、克隆球形成和化疗抵抗性等方面具有重要作用,可能是胃癌干细胞新型标志物,有望成为胃癌生物治疗的新靶点.     

雄激素和雌激素受体与食管癌的关系

目的 通过测定食管癌组织中雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）的含量,探讨食管癌生物学行为与AR和ER的关系。方法 应用放射配体结合分析法定量测定31例食管癌患者癌组织中AR和ER的含量,并与正常食管黏膜组织作对照。结果 与正常食管组织比较,食管癌组织中存在较多的AR和ER,其含量与患者性别、分化程度、浸润程度、有无淋巴结转移有关（P＜0．05）,而与患者年龄、肿瘤的部位无明显关系（P＞0．05）。结论 AR和ER含量与食管癌生物学行为关系密切,可能为食管癌的防治提供新的方法,并作为评价食管癌患者预后的新指标。     

应用RNA干扰下调多药耐药蛋白4表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响

目的探讨多药耐药蛋白4（MRP4）表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰技术（RNAi）稳定下调人结直肠癌细胞株HCT116中MRP4的表达。将HCT116细胞分为未感染任何病毒的细胞株（CON）、加阴性对照病毒感染的细胞株（NC）和加RNAi靶点病毒感染的细胞株（KD）3组,应用实时定量RT-PCR和Western blot分别从RNA和蛋白水平检测MRP4表达变化,以验证RNAi的有效性。4Gy剂量照射后24h,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测细胞增殖,比较RNAi后HCT116细胞株照射敏感性的差异。结果成功构建并转染慢病毒质粒,获得稳定沉默MRP4表达的HCT116-KD细胞株,HCT116-KD细胞株MRP4mRNA和蛋白表达水平较对照均明显下调（P〈0．05）。照射后24h,KD细胞株凋亡率为（71．7±0．8）％,明显高于CON组[（56．1±0．9）％]和NC组[（59．8±0．8）％]（P〈0．05）。照射后48h和72h,KD细胞增殖能力较对照组明显下降（火0．05）。结论MRP4在结直肠癌细胞中的表达水平与照射耐受显著相关,应用慢病毒感染RNA干扰下调MRP4表达可以增强结直肠癌细胞照射敏感性。MRP4有可能成为预测放疗敏感性的分子标志物。     

人皮肤成纤维细胞体外转染Brgl基因的实验研究

目的探讨重组Brgl基因转染人皮肤成纤维细胞的可行性,以及转染对细胞增殖和活性的影响。方法体外重组Brgl基因,借助真核表达载体系统,转入体外培养的人皮肤成纤维细胞;通过流式细胞仪检测报告基因表达,并确定细胞转染效率：应用ReahimePCR比较转染前后BrglmRNA的表达;MTT法检测Brgl基因对细胞增殖能力的影响。结果Brgl基因转染后,（73．0±6．7）％的被转染细胞表达报告基因;BrglmRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为（6．23±1．18）、（1．11±0．22）和（1．52±0．12）,转染组BrglmRNA相对表达量较未转染组及转染空载体组明显增高（P〈0．01）;细胞的增殖能力在Brgl基因转染前后无显著差异。结论人皮肤成纤维细胞可作为Brgl转染的靶细胞．转染Brgl基因对人成纤维细胞的增殖能力无显著影响。     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

重组LIGHT-Fc基因对食管鳞癌Eea109细胞生长的抑制

目的 研究重组LIGHT-Fc基因对食管鳞癌Eca109细胞的抑制效应.方法 以脂质体介导LIGHT-Fc基因转染食管鳞癌Eca109细胞,观察基因转染后对Eca109细胞体外生长的影响.建立荷瘤裸小鼠模型,分为野生型组(Eca109/Wt)、转空质粒组(Eca109/neo)和实验组(Eca109/LIGHT),每组15只.观察各组成瘤情况和瘤组织的病理表现.结果 Eca109细胞中有LIGHT受体的表达,转染LIGHT-Fc基因后,瘤细胞的生长被抑制.野生型组、转空质粒组和实验组成瘤分别为12、11和5只,实验组与其余两组比较差异有统汁学意义(X2=6.652,4.821,P<0.05).病理检查显示在实验组小鼠瘤组织中存在较为明显的坏死.结论 LIGHT-Fc基因的表达对食管鳞癌Eca109细胞具有体内和体外抑制作用.     

PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达,探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平;应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116,Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113,显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后,LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05）,细胞增殖能力显著降低,软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。     

环状RNA circPRDM5在食管鳞状细胞癌中的表达和功能研究

［摘要］ 目的 探索环状RNA circPRDM5在食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞和组织中的表达水平,及其对ESCC细胞功能的影响。方法 qRT?PCR检测circPRDM5在正常食管上皮细胞（HEEC）、ESCC细胞系、和44例ESCC组织及对应的癌旁正常组织中的相对表达水平;Transwell实验和CCK8实验分别检测siRNA沉默circPRDM5后,对细胞迁移侵袭和增殖功能的影响;构建裸鼠成瘤模型,检测circPRDM5对ESCC细胞在动物体内成瘤能力的影响。结果 与HEEC相比,circPRDM5在ESCC细胞系KYSE150、ECA109中高表达（P<0.05）,且在ESCC组织中表达（2.90±0.18）较癌旁正常组织（2.01±0.15）表达高（P<0.001）。Transwell实验和CCK8实验证明,沉默circPRDM5能明显抑制ESCC细胞的迁移侵袭和增殖能力（P<0.05）;裸鼠成瘤实验结果表明,沉默circPRDM5后,ESCC细胞的成瘤体积和重量较对照组明显下降（P<0.01）。结论 circPRDM5在ESCC的细胞和组织中高表达。在ESCC细胞中沉默circPRDM5能降低ESCC细胞的增殖、迁移侵袭、和在动物体内的成瘤能力。提示circPRDM5可能成为ESCC治疗的一个新靶点。