活动性肺结核患者PBMCs中INHBA基因的表达

目的研究活动性肺结核患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中抑制素βA亚基(inhibin, beta A, INHBA)基因的表达特点。方法使用密度梯度离心法分离PBMCs,然后用TRIzol提取细胞RNA,逆转成cDNA后,进行荧光定量PCR分析INHBA的表达。结果结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液和结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10的多肽,显著性提高PBMCs中INHBA基因的表达,配对t检验p值分别为0.019和0.0013;在无抗原刺激的情况下,活动性肺结核与正常对照之间无显著差别(P=0.52);当使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液和结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10的多肽刺激PBMCs,INHBA在活动性肺结核患者组的表达显著性的高于正常对照组,t检验P值分别为0.016和0.010。结论 INHBA在结核抗原刺激后在PBMCs表达显著性升高,且在活动性肺结核患者组显著高于正常对照组,可能作为活动性肺结核的诊断标志物。     

白纹伊蚊基因表达定量PCR内参基因的选择

目的筛选白纹伊蚊基因表达定量PCR研究中适合的内参基因。方法采用实时荧光定量PCR技术,对β-ac-tin、BTF3a、rsp5、rsp27a、superoxide、rspL40六个看家基因的mRNA表达水平进行了探讨。结果除rsp27a基因扩增效率高于设定值被剃除外,余5个基因在不同组织中的表达稳定度为rspL40,BTF3a〉rsp5〉β-actin〉superoxide;吸血不同时相表达稳定度为rspL40,rsp5〉superoxide〉BTF3a〉β-actin。结论 rspL40,BTF3在不同组织中表达最稳定;rspL40,rsp5在吸血不同时相表达最稳定。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

人KIM-1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的制备用于人KIM-1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒。方法通过PCR扩增出目的片断,纯化PCR产物与p MD18-T载体连接,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确。提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立KIM-1质粒标准品。结果 KIM-1基因目的片段成功重组至p MD18-T载体上,扩增目的片段长度为131 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库KIM-1序列性一致。结论成功构建KIM-1基因实时荧光定量PCR标准品质粒。     

人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立

目的：建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法：依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物,以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版,以TBP基因为参照基因,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果：POT1和TBP基因熔解曲线为单峰,无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同（直线斜率0．0171〈0．1）。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3％和2.1％;TBP基因批内变异与批间变异分别为1．2％和2．6％。结论：建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法,该方法简单快速,经济,灵敏度高,特异性和重复性好,可用于人类POT1基因的定量分析。     

人类SUZ12基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类SUZ12基因的方法.方法:将SUZ12 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测SUZ12,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为14.2,线性范围为1.42×10~1-1.42×10~8拷贝,相关系数r为-1.00,1.42×10~7拷贝/L标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.8%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(melting temperature,Tm)为(81.37±0.16)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测SUZ12基因,快速有效、灵敏度高、特异性好.     

实时定量PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因的临床意义

目的 探讨实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病（APL） PML/RARα融合基因表达水平的意义.方法 用扩增培养的NB4细胞的PML/RARα融合基因进行梯度稀释作为标准品,ABL作为内参,建立标准曲线.采用TaqMan法进行实时定量PCR,并对方法的可靠性、可重复性及灵敏性进行测定.对14例APL患者在初治、诱导缓解及巩固治疗3个时期的PML/RARα mRNA转录本水平进行动态定量监测,结果以NQ表示,NQ=PML/RARα mRNA的拷贝数/ABL mRNA的拷贝数×105.结果 实时定量PCR方法可以检测出1×10-5μ g NB4细胞cDNA中PML/RARα的融合基因,其重复性和稳定性Ct值变异系数分别为1.77％和2.11％.14例患者初治时骨髓PML/RARα融合基因平均水平为3 731,经全反式维甲酸、三氧化二砷双诱导缓解时PML/RARα融合基因平均水平为231,化疗与维甲酸序贯巩固治疗2个疗程后PML/RARα融合基因平均水平为116.治疗前后比较,PML/RARα基因转录本水平明显下降（P＜0.05）.结论 实时定量PCR检测PML/RARα融合基因表达敏感性好、特异性高、重复性好,可用于急性早幼粒细胞的诊断和微小残留病的检测.     

荧光实时定量PCR方法在肺癌相关基因检测中的应用

目的研究实时定量荧光PCR在非小细胞肺癌患者肿瘤组织、正常组织及外周血中RRM1、ERCC1表达水平检测的应用价值。方法构建目的基因质粒标准品,运用PCR仪进行SYBR荧光实时定量分析,比较其表达水平。结果两者在外周血中表达水平与TNM分期、是否淋巴转移等有关;肿瘤组织和外周血中的表达具有一致性。结论荧光实时定量PCR具有良好的特异性和灵敏度,费用低,操作简便,可应用于临床检验工作。     

初治活动性肺结核患者耐药性分析

目的了解初治活动性肺结核患者耐药状况,为初治活动性肺结核的临床诊治提供依据。方法收集2013年8月至2014年2月广东省佛山市禅城区结核病控制项目登记的初治活动性肺结核患者203例,对分离出结核分枝杆菌菌株84例进行一线抗结核药物(Sm、INH、RFP、EMB)耐药情况检测并进行分析。耐药率之间的差异性比较采用SPSS16.0统计软件的χ2检验,P0.05为差异有统计学意义。结果 84株结核分枝杆菌的总耐药率为16.67%(14/84),初治涂阳肺结核患者耐药率为20%(11/55),初治涂阴肺结核患者耐药率为10.34%(3/29);总耐多药率为5.95%(5/84),初治涂阳肺结核患者耐多药率为7.27%(4/55),初治涂阴肺结核患者耐多药率为3.45%(1/29)。初治涂阳肺结核患者抗结核药物耐药率顺位为SmINHRFPEMB[Sm 16.36%(9/55)、INH 14.55%(8/55)、RFP 7.27%(4/55)、EMB 3.64%(2/55)],初治涂阴肺结核患者顺位为INHSmRFP=EMB[Sm 6.90%(2/29)、INH 10.34%(3/29)、RFP 3.45%(1/29)、EMB3.45%(1/29)]。男性耐药率为22.64%(12/53)、女性耐药率为(6.45%(2/31)。初治涂阳与涂阴肺结核患者总耐药率差异无统计学意义(χ2=0.674,P0.05);初治活动性肺结核患者不同性别耐药率差异无统计学意义(χ2=3.691,P0.05)。结论初治活动性肺结核患者耐药状况不容乐观,应加强对现有临床诊治方法的研究。     

活动性肺结核患者与潜伏感染者差异表达基因的生物信息学分析

目的寻找活动性肺结核患者与潜伏感染者免疫功能差异的重要分子。方法收集活动性肺结核患者和潜伏感染者PBMCs进行转录组测序,分析数据获得差异表达基因,对差异表达基因使用软件MeV进行聚类分析,用DAVID数据库进行GO分析,用STRING数据库进行蛋白相互作用网络分析,用Cytocapase软件进行KEGG分析和蛋白质复合物分析。结果共获得差异表达基因98个,其中上调基因67个,下调基因31个;GO分析生物进程富集的词条是“免疫反应”、“天然免疫反应”和“中性粒细胞趋化”;KEGG分析结果显示富集词条是“自然杀伤细胞介导的细胞毒作用”、“抗原处理和递呈”和“IL17信号通路”等信号通路,其中IFNG、ITGAM、MMP1和FOS基因连接多个信号通路;构建蛋白相互作用网络,筛选到聚集程度高的分子ELANE、ITGAM、MMP9和ARG1;而蛋白复合物分析显示由上调基因组成的复合物1和复合物2、由下调基因组成的复合物3。结论连接多个信号通路或者聚集程度高的重要分子和大分子复合物可能在活动性肺结核患者与潜伏感染者免疫功能差异具有重要的作用,有待我们进一步的实验验证及功能研究。     

实时荧光定量PCR检测肝癌患者外周血甲胎蛋白mRNA水平

在生理状态下 ,甲胎蛋白 (AFP)基因主要由胎肝细胞表达产生 ,出生后该基因表达迅速受到抑制。肝细胞大量坏死或发生原发性肝癌时 ,AFP基因再次激活[1] 。我们采用以Taqman技术为基础的实时荧光定量PCR技术 ,检测各型肝癌患者外周血细胞中AFPmRNA水平 ,分析外周血中是否存在肝癌细胞 ,并判断该方法检测肝癌细胞血液转移的可行性。一、材料与方法1 病人与标本 :本院 2 0 0 2年 8～ 12月收治的 5 7例肝癌患者 ,血清学AFP检测阳性 ,经影像学、组织病理学检查确诊为原发性肝癌。抽取肝癌住院患者晨血 5ml,EDTA抗凝。对照组为健康体检者…     

活动性肺结核患者的重复结核菌素试验

人群对分支杆菌的暴露增加时,结核菌素的反应率和反应强度也增加,如重复卡介苗(BCG)免疫即如此.提示如无减敏因素影响,分支杆菌负荷高者,结核菌素反应可以很高。结核菌素反应可评价人类对分支杆菌反应的遗传性调节,所以研究分支杆菌最大暴露时的皮试情况有重要意义。为此分析了有和无BCG免疫的新近发作肺结核患者结核菌素反应强度,以及治疗后反应的稳定性。受试者均为病史2年以上肺结核患者,并新近诊     

霍乱弧菌基因表达分析中内参基因的选择

目的确定不同实验条件下基因表达分析中的稳定内参基因。方法以霍乱弧菌O1群El Tor菌株为研究对象,利用qRT-PCR方法比较不同pH值(pH 8.0、pH 5.5)以及不同温度(37℃、30℃)等多种生理、外界环境模拟培养条件下,thyA、recA、rpoA、gyrB、16SrRNA以及VCA0862 6个候选内参基因的表达水平,利用geNorm软件评价其稳定性。结果不同培养条件下,6个候选内参基因表达水平存在差异。不同pH值条件下最佳基因是recA;不同温度条件下最佳基因是gyrB;不同pH值及温度综合评价时,最佳基因是recA。结论本研究评价和提出了细菌基因表达分析中内参基因筛选的重要性,不同实验条件下最稳定内参基因是不同的,针对不同条件下的基因转录定量分析,应分别对内参基因稳定性进行评价并选择最稳定基因。     

实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

铜绿假单胞菌quiP基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的：制备用于铜绿假单胞菌PAO1 quiP基因（PA1032）实时荧光定量PCR检测的质粒标准品pMD18-quiP。方法：通过PCR扩增出目的片断,纯化后连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆,通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确,大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析。结果：quiP基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论：成功构建了quiP基因实时荧光定量PCR质粒标准品。     

应用TaqMan实时荧光定量PCR技术研究系统性红斑狼疮疾病相关基因的表达

目的验证新发现的4个系统性红斑狼疮(SLE)相关基因与SLE发病的相关性,为SLE发病的分子机制研究提供资料。方法前期基因芯片工作中筛选得到4个在55例SLE患者及正常对照之间表达差异显著的基因,染色体定位发现其位于SLE连锁的染色体区段。应用TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测该4种基因在SLE患者和正常对照外周血单核细胞及T、B淋巴细胞的表达。结果SLE患者外周血单核细胞中,TRIM基因ΔCt值显著低于正常人对照(P＜0．05),基因表达水平为正常对照的0．61倍；IL-4R基因与EGR1基因的ΔCt值显著高于正常人对照(P＜0．05),基因表达水平分别为正常对照的2．62、2．03倍；KLRC1基因的ΔCt值显著高于正常人对照(P＜0．01),基因表达水平为正常对照的5．33倍。在SLE患者外周血T细胞,TRIM基因ΔCt值显著低于正常人对照(P＜0．01),基因表达水平为正常对照的0．56倍；IL-4R基因与EGR1基因的ΔCt值显著高于正常人对照(P＜0．05),基因表达水平分别为正常对照的2．55、1．74倍；KLRC1基因的ΔCt值显著高于正常人对照(P＜0．01),基因表达水平为正常对照的5．19倍。在SLE患者外周血B淋巴细胞,由于B细胞淋巴所占淋巴细胞比率过低,基因检测数据不稳定,故未作统计学分析。4种狼疮疾病相关基因与狼疮活动指数SLEDAI无相关性。结论SLE患者TRIM,IL-4R,KLRC1和EGR1基因与正常人相比有明显差异,但与疾病活动程度无关。     

实时荧光定量PCR检测直肠癌XPC基因表达

目的 检测核苷酸切除修复（NER）基因XPC在直肠癌及直肠组织中的表达。方法采用实时定量荧光PCR法,检测16例手术后切除的新鲜直肠癌组织及6例癌旁直肠组织中XPC基因表达水平。结果直肠癌中XPC基因水平明显高于正常直肠组织。结论高表达的XPC基因直接在NER早期发挥着重要作用,在一定程度上导致直肠癌患者对化疗药物的敏感性降低。     

实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR是通过荧光信号监测目的基因扩增数量的定量PCR技术,具有灵敏度高,检测速度快等优点。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病毒、登革热病毒、流感病毒、水疱口炎病毒等病毒的快速检测,在病毒快速分型、相似病毒的鉴别检测、耐药病毒突变体检测等临床和公共卫生领域得到广泛应用。狂犬病是危害严重的人兽共患病,病死率几乎为100%。实时荧光定量PCR技术已被应用于狂犬病病毒和狂犬病相关病毒的核酸检测,具有与金标准DFA相当的灵敏度和特异度,同时克服了金标准DFA的某些局限性,如检测速度更快,无需提取脑组织,对唾液、脑脊液等低病毒载量样本具有较好的检出效果,具有成为人间狂犬病诊断技术的潜力。灵敏度是传统RT-PCR的200倍以上,交叉污染的风险更低。实时荧光定量PCR也应用于欧洲蝙蝠病毒等狂犬病相关病毒的检测,可建立多重实时荧光定量PCR在单一检测体系对多种病毒进行快速鉴别,对于预防病毒性传染病具有重要的公共卫生意义。本文详细介绍了该技术的相关原理和方法,以及在病毒检测方面的国内外研究进展。