大鼠MIP3基因的电子克隆和特性分析

210．seq是一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用GENSCAN预测、Blast(Basic local alignment search tool)比对、序列拼接、多序列比对等生物信息学方法克隆了该EST代表的大鼠MIP3基因的cDNA序列。大鼠MIP3基因的开放阅读框为1332bp，起始密码子前同一相位存在一个终止密码子，起始密码子邻近的序列符合Kozak规则；推测编码443个氨基酸，与小鼠和人的MIP3基因ortholog的同源性很高，但是与数据库中其它蛋白质的同源性不高。TMpred分析显示该多肽有一个跨膜区域，氨基端位于膜内。Motifscan分析仅发现一个脯氨酸富集区域。以上结果显示MIP3基因是一个功能未知的新基因。     

大鼠MIP3基因的电子克隆和特性分析

210 .seq是一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签 (expressedsequencetag ,EST) ,用GENSCAN预测、Blast(Basiclocalalignmentsearchtool)比对、序列拼接、多序列比对等生物信息学方法克隆了该EST代表的大鼠MIP3基因的cDNA序列。大鼠MIP3基因的开放阅读框为 1332bp ,起始密码子前同一相位存在一个终止密码子 ,起始密码子邻近的序列符合Kozak规则 ;推测编码 4 4 3个氨基酸 ,与小鼠和人的MIP3基因or tholog的同源性很高 ,但是与数据库中其它蛋白质的同源性不高。TMpred分析显示该多肽有一个跨膜区域 ,氨基端位于膜内。Motifscan分析仅发现一个脯氨酸富集区域。以上结果显示MIP3基因是一个功能未知的新基因     

乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3024bp的乳糖酶基因,利用生物软件分析,推测乳糖酶基因共编码1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4．9,氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征,为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。     

一条人类砷相关新cDNA基因的克隆及生物信息学分析

目的 :探讨砷化物与基因的相互作用 ,克隆砷相关基因 ,利用生物信息学技术分析克隆基因。方法:采用 SMART方法构建 c DNA文库 ,杂交筛选并克隆基因 ,利用生物信息学手段对克隆基因进行结构和功能的分析。6 μm ol/ L Na As O2 处理人正常肝 L- 0 2细胞 2 h,抽提 RNA做基因芯片杂交。结果:成功克隆一条新基因 ,生物信息学分析发现在 7到 4 5 6碱基范围内有一个完整的 ORF,在编码起始区有典型的 Kozak序列 ,编码 14 9个氨基酸的蛋白质。核酸同源性比对发现与人类 1p36 .2 - 36 .3染色体 DNA序列同源性达 98% ,编码蛋白质同 Alu亚家族 SB序列同源性达 85 %。染砷细胞基因芯片杂交发现克隆基因表达增高。结论:克隆的人类砷相关基因 ,编码蛋白质与Alu亚家族 SB序列同源性高。     

白细胞介素6诱导相关新基因的克隆与鉴定

白细胞介素 6 (ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ 6 ,ＩＬ 6 )是一种多功能的细胞因子[1] 。其作用于敏感细胞时 ,必将在胞内产生一系列新的信号分子。克隆这些受ＩＬ 6调控的新基因 ,必将有助于进一步阐明ＩＬ 6的信号转导机制及ＩＬ 6与某些疾病的相关性。我们用ｃＤＮＡ代表性差异分析 (ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃＤＮＡ ,ｃＤＮＡ ＲＤＡ)法在Ｕ937细胞中分离了与ＩＬ 6相关的基因。一、材料与方法1 ｍＲＮＡ提取 :Ｕ937细胞培养在含 10 %小牛血清的ＲＰＭＩ16 40培养基中 ;一组用 10 0ｎｇ/ｍ…     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

人新基因EOLA1生物信息学分析

目的预测人类新基因EOLA1的生物学功能。方法基于EOLA1全长cDNA序列,应用生物信息方法,从序列比对、染色体定位、基因结构分析、编码蛋白理化性质分析、蛋白质位点和序列模式预测等几个方面对EOLA1进行分析。结果EOLA1编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白;EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源,到目前为止,对鼠111002L19蛋白功能也不清楚;应用辐射杂交细胞系（RH）作图系统发现EOLA1定位于Xq27．4;对其二级结构进行预测发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点以及1个螺旋-转角-螺旋（HTH）基序。结论人新基因EOLA1编码蛋白质的一级和二级结构特征赋予EOLA1信号转导能力,有可能作为信号分子在LIDS激活人血管内皮细胞的过程中发挥作用。     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

人hole基因的克隆和序列分析

目的 克隆人的hole基因,并进行生物信息学分析.方法 以胚胎心脏cDNA文库为模板,进行PCR扩增得到hole基因的ORF.并进行亚克隆入PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,用Xho1进行酶切和测序鉴定阳性克隆.利用Internet和GeneBank数据库对测序结果正确的hole基因进行生物信息学分析. 结果克隆了hole基因,测序结果正确;生物信息学分析表明, hole基因开放读码为960 bp,编码319个氨基酸;同源性分析表明,人的hole与鼠、鸡hole蛋白具有高度同源性.多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在心脏、肝脏、肺、脑、肾脏、脾脏、胰脏均有表达,其心脏表达最高. 结论成功克隆hole基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.     

小鼠衰老相关新基因Arzc的克隆

目的鉴别和克隆与小鼠衰老相关的新基因.方法采用改进的差异显示反转录聚合酶链反应(DDRT-PCR)技术分析正常老化和年轻BALB/C小鼠大脑皮层mRNA的差异表达,差异显示的新表达序列标签(EST)经Northern杂交验证后,作为出发序列,利用生物信息学方法设计引物,以小鼠大脑皮层总RNA的反转录产物为模板通过PCR克隆全长cDNA.结果差异显示分析共获得表达差异明显的EST 42条,序列同源性分析显示其中29条为已知基因cDNA片段,13条可能为新EST.对新EST进行Northern杂交验证后,对确证在正常老化鼠皮层表达明显下调的1个EST,通过生物信息学方法克隆全长cDNA,得到1个新的1 382 bp的cDNA序列,命名为Arzc,获得GenBank注册号AY344585.该序列含有1个261 bp的开放阅读框,推测的编码多肽包含86个氨基酸残基,与噬菌体编码的重组酶/整合酶的一段氨基酸序列有较高同源性.结论鉴别并克隆到一个可能与小鼠衰老相关的新基因Arzc.     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

Cloning and characterization of a novel gene encoding a putative seven-span transmembrane protein localized in endoplasmic reticulum

To clone and analyze the structure of a novel gene, named EST-1 (endoplasmic reticulum-localized seven-span transmembrane protein-1) and to analyze the expression pattern and intracellular location of EST-1. Methods:The cDNA library was screened to isolate novel cDNA fragment. The structure of novel gene was analysed by computer software. Expression of EST-1 was analyzed by dot blot and Northern blotting, Intracellular localization was observed after EST-1-enhanced green fluorescence protein (EGFP) fusion gene was transfected into mammalian cells. Results: The full-length cDNA of mouse EST-1 was 1 802 bp, with a 1 293 bp open reading frame encoding 431 amino acids. It was predicated that protein encoded by FST-1 contained a signal peptide sequence at the N-terminus, seven putative transmembrane domaius,and an ER-retaining signal at the C-terminus, EST-1-EGFP fusion protein showed an ER-like intracellular distribution in mammalian cells. Expression pattern analysis showed that EST-1 is expressed in all tissues examined. Conclusion: EST-1 is encoding a putative seven-span transmembrane protein localized in endoplasmic retieulum. EST-1 was expressed in all tissues examined, suggesting an essential function of EST-1 in cells.     

一个新的基因转录本的克隆及序列分析

目的：筛选与精子发生和(或)睾丸发育相关的基因。方法：将不同发育阶段(胚胎和成人)的睾丸组织cDNA探针与人睾丸cDNA芯片进行杂交，通过杂交信号的比较，筛选出差异表达的基因。结果与结论：经测序发现该基因全长1316bp，包含1个1056bp的开放阅读框，编码351个氨基酸。生物信息学序列分析表明，它是p44S10基因家族的一条新的转录本基因，该基因的氨基酸序列编码一26S蛋白酶体调控亚基，在进化中高度保守，提示了该基因在生物体中的重要作用。     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2相关新基因Rcet3的克隆

目的 利用NCBI中的DDD(数字差异显示)数据库及RT-PCR技术克隆睾丸等组织中特异表达的新基因.方法 利用NCBI中的DDD数据库首先电子克隆了Rcet3基因,并从成年小鼠睾丸组织中利用RT-PCR克隆出Rcet3全长基因,然后测序及序列分析.结果 序列分析显示,Rcet3基因全长cDNA为610bp,含4个外显子,编码一个140个氨基酸残基的蛋白,该蛋白含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用足重要的.Rcet3在成年老鼠睾丸、附睾和大脑等生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet3与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征.结论 Rcet3可能是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,Cres亚家族中的一个新成员.     

一种新的芳烃双加氧酶基因的克隆和功能研究

芳烃双加氧酶是多环芳烃在细菌中降解的起始关键酶.本研究通过基因组步移法从地杆菌(Terrabacter sp.)中克隆出一种新的双加氧酶基因.采用pET17b载体表达该基因,在共表达电子传递链蛋白的条件下检测获得双加氧酶活性.通过高效液相色谱和气相色谱-质谱分析发现该基因产物可以催化菲、芘和荧蒽生成相应的顺式双羟基产物,表明该基因为一种新型高分子多环芳烃降解基因.     

一个新的高血压病相关基因的克隆和表达

目的寻找和克隆新的高血压病相关基因，探讨高血压病的发病机制。方法应用差异显示筛选的方法，对正常（ＷＫＹ）大鼠和自发性高血压病大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞进行ＲＮＡｍａｐｐｉｎｇ分析，选择下调的ｃＤＮＡ进行克隆。结果获得一个新的ｃＤＮＡ，其长度为４１６０ｂｐ，可编码５５１个氨基酸，蛋白质分子量为６２６４４。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，这一基因不仅存在于血管平滑肌细胞中，而且也广泛分布在大鼠心、肾、脑、肺和肝组织中。这一基因在ＳＨＲ大鼠的心、肾、脑、肝中低表达，在ＷＫＹ大鼠高表达；血管紧张素ＩＩ、内皮素－１、ＩＬ－１等致血管平滑肌细胞增殖和高血压的因素可以抑制这一基因的表达，其作用可为相应的拮抗剂所阻断；心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素等抑制血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖和降低高血压的因素可以上调这一基因的表达。结论获得了一种新的与血管平滑肌细胞增殖或高血压相关的基因，它可能拮抗ＶＳＭＣ增殖，在高血压的发生中起重要作用。     

一种新的睾丸特异核孔蛋白基因特性的研究

目的通过筛选人睾丸特异基因及对其结构和功能的研究,为阐明精子发生与成熟提供新的线索。方法采用筛选人睾丸表达文库、快速扩增ｃＤＮＡ５′末端、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析、荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）以及基因重组等技术。结果（１）获得一新的长度为２２０９ｂｐ的ｃＤＮＡ,编码７００个氨基酸,将该基因命名为ＢＳ－６３。Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ注册号为Ｕ６４６７５。（２）ＢＳ－６３Ｎ端具有核孔蛋白的特征性结构元件“ＸＦＸＦＧ”或“ＦＧ”以及与Ｒａｓ相关核蛋白（Ｒａｎ）结合的典型特征。（３）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示,ＢＳ－６３基因有６．０和８．５ｋｂ两种转录形式,其中６．０ｋｂ为睾丸组织特异性转录本。（４）ＦＩＳＨ显示,ＢＳ－６３基因定位于２ｑ１１．２～１２。（５）ＢＳ－６３ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得高效表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,表达蛋白的相对分子质量约为８００００。（６）体外功能实验表明,该表达蛋白可被蛋白激酶Ｃ及细胞周期依赖性蛋白激酶Ⅱ磷酸化。结论ＢＳ－６３可能是一种新的睾丸特异核孔蛋白。     

人cGAS 基因启动子的克隆鉴定及功能初探

目的：构建人环鸟苷酸?腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate?adenosine monophosphate synthase,cGAS）基因启动子,确认其活性,进而对转录调控机制进行初步探究。方法：采用 PCR 方法扩增人cGAS 基因 5′上游 1 254 bp（-1 178~+76 bp）的片段,酶切后连接到pGL3?basic 质粒,以该质粒为模板合成不同长度的启动子质粒。通过双荧光素酶报告基因实验验证不同质粒在Hela细胞中的活性,利用生物信息学方法预测启动子区存在的转录因子结合位点。通过点突变实验验证潜在的转录因子结合位点。结果：人cGAS启动子质粒初步构建成功。转染后,cGAS 启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P＜0.05）。人cGAS近端启动子区域（-414~+76 bp）经生物信息学软件分析可能含有 Sp1、CREB、USF1、RAP1、C?JUN、OCT?1等转录因子的结合位点。点突变实验证实Sp1、CREB正向调控该启动子区域。结论：人cGAS近端启动子区域（-414~+76 bp）存在较强的启动子活性,该区域含有多个潜在的转录因子结合位点。转录因子Sp1、CREB调控人cGAS启动子区。     

6个弓形虫新基因的克隆与分析

目的 :克隆并分析弓形虫新的抗原基因 ,为弓形虫病疫苗的研制提供有效的候选抗原分子。方法 :以弓形虫RH株速殖子感染大鼠血清作为探针筛选弓形虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增及DNA序列测定。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果 :共筛选出 13个阳性克隆 ,其插入片段大小分别为 0 .4 5～ 2 .4kb。通过测序分析 ,其中新基因L3,L6 ,L7和L13分别编码 4 9,5 9,16 0和 76个氨基酸组成的非跨膜蛋白 ;新基因L11和L12基因分别编码 5 5 0和 114个氨基酸组成的跨膜蛋白。结论 :阳性克隆的筛选和鉴定可为抗弓形虫病疫苗的研制奠定基础