3xTg-拟AD小鼠脑内七种时钟基因启动子区甲基化分析

目的 应用新的动物模型,建立一种快速简便的方法检测7种主要时钟基因per1、per2、cry2、clock、npas2、bmal1和bmal2启动子区甲基化状态,探索阿尔茨海默症引起的生理节律紊乱机制。方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法,检测15例3xTg拟阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)小鼠和15例转基因阴性对照小鼠全脑7种时钟基因启动子区CpG岛甲基化水平。结果 在转基因阳性小鼠中检测到3例cry2基因、1例clock和1例bmal2时钟基因发生甲基化现象,在对照组小鼠中未检测到时钟基因甲基化。结论 启动子区甲基化这种表观遗传学修饰参与节律基因表达的调控,可能是AD疾病中时钟节律紊乱发生的重要原因。     

帕金森病患者时钟基因启动子区甲基化分析

目的分析帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者和正常老年对照组时钟基因启动子区甲基化水平,探讨帕金森病患者时钟基因异常表达的机制。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)法,检测206例帕金森病患者和181例正常老年对照者的7种时钟基因启动子甲基化水平。结果 7种时钟基因中,cry1和npas2启动子区存在明显甲基化。另5种时钟基因启动子(per1、per2、cry2、clock、bmal1)未发现明显甲基化。PD患者中npas2甲基化频率明显下降。结论 PD患者时钟基因的异常表达可能与时钟基因启动子区甲基化的改变有关。     

转染DJ-J和DJ-1^L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1^L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究，为进一步建立DJ-1和DJ-1^L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础。方法采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段，采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变，分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1^L166P重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pEGFP-DJ-1、pEGFP-DJ-1^L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测。结果pEGFP—DJ-1、pEGFP-DJ-1^L166P、pEGFP—C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后，分别获得6、2、9个阳性细胞克隆，RT—PCR及western blot方法进行tau基因表达检测，结果均显示pEGFP—DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP—C3质粒转染组，而pEGFP—DJ-1^L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP—C3质粒转染组，实验结果统计学分析均具有明显差异（P〈0．05）。结论在转录水平及蛋白质水平，DJ-1基因使tau基因的表达下降，而DJ-1^L166P使tau基因表达上升。在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性。     

转染DJ-1和DJ-1L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的 在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究,为进一步建立DJ-1和DJ-1L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础.方法 采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段,采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变,分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pEGFPDJ-1、DEGFP-DJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测.结果 pEGFP-DJ-1、pEGFPDJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后,分别获得6、2、9个阳性细胞克隆,RTPCR及westem blot 方法进行tau基因表述检测,结果均显示pEGFP-DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP-C3质粒转染组,而pEGFP-DJ-1L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP-C3质粒转染组,实验结果统计学分析均具有明显差异(P＜0.05).结论 在转录水平及蛋白质水平,DJ-1基因使tau基因的表达下降,而DJ-1L166P使tau基因表达上升.在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性.     

竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达

目的 构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,为进一步研究DJ-1M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定.结果 pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1 M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I重组表达质载体.     

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的：构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果：重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论：成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

小鼠不同细胞间组蛋白修饰变化对MafA基因转录表达的影响

目的通过比较不同细胞类型之间MafA基因转录起始区的组蛋白修饰差异,探讨组蛋白修饰对MafA基因转录表达的作用。方法采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胰岛素瘤β细胞(NIT-1)、NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)及小鼠胚胎干细胞(mES)三者中的MafA和MLH1基因转录起始区组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述三种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果 (1)以mES细胞为参照,NIT-1细胞MafA基因的转录起始区的H3K4m3修饰水平明显增高(P<0.05),H3K9m3修饰水平明显降低(P<0.05);NIH 3T3细胞MafA基因的转录起始区的H3K9m3修饰水平明显增高(P<0.05),H3K4m3修饰水平明显降低(P<0.05);(2)MafA基因的仅在NIT-1细胞表达,其表达与H3K4m3修饰存在直线相关(相关系数0.995);与H3K9m3修饰存在直线负相关(相关系数-0.751);(3)管家基因MLH1的表达与所检测组蛋白修饰无相关性。结论 H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控MafA基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要的意义。     

大鼠胶质瘤细胞中生物钟基因Period2的生物节律性研究

目的揭示生物钟基因Period2(Per2)在鼠胶质瘤C6细胞内周期表达规律。方法采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)分别刺激体外培养的大鼠胶质瘤C6及NIH3T3细胞,在ZT0-ZT48之间设14个时间点,最初PMA的刺激时间记为ZT0,均在PMA刺激后每隔4h分别提取C6及NIH3T3细胞总RNA。利用标准曲线法Real-time PCR检测相应时间点Per2的mRNA的表达水平。结果 C6细胞中生物钟rPer2基因表达最高点在ZT28,最低点在ZT16;NIH3T3细胞中生物钟mPer2基因表达最高点在ZT24,最低点在ZT12,两者均呈现明显的节律性;C6细胞与NIH3T3细胞同时间点Per2基因表达差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论经PMA诱导后,Per2在C6及NIH3T3细胞均呈节律性表达,但二者表达节律存在明显差异,可作为研究生物种基因与胶质瘤的时间生物治疗的理论基础。     

基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的：基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。方法：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。结果：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^-1,纯度为1.50～1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^...     

基于时钟基因启动子区甲基化的胃癌患者预后预测模型的建立与验证

目的建立基于时钟基因启动子区甲基化的胃癌患者预后的预测模型并验证其效能。方法选取2015年1月—2018年1月浙江中医药大学附属二院收治的胃癌患者459例,术后随访2年,根据复发情况分为复发组和未复发组。对比2组患者一般资料、手术相关资料、时钟基因启动子区甲基化情况,行多因素logistic回归分析研究复发的独立影响因素,使用R软件建立复发的预测模型,并验证其效能。结果随访过程中5例患者失访,剩余454例患者中,217例肿瘤复发列为复发组,其余237例未复发列为非复发组,胃癌复发率为47.80%(217/454)。2组分化程度、淋巴结转移、肿瘤生长方式以及per1、per2、cry1、clock时钟基因启动子区甲基化差异有统计学意义(均P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,分化程度(OR=0.519,P=0.006)、淋巴结转移(OR=2.365,P<0.001)、肿瘤生长方式(OR=0.616,P=0.036)、per1(OR=24.108,P<0.001)、per2(OR=2.152,P=0.008)、cry1(OR=3.131,P<0.0...     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

哺乳动物细胞CDK3系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）在哺乳动物细胞的表达载体,并在真核细胞NIH3T3中进行初步表达。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CDK3编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK3片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,并用蛋白免疫印迹法进行初步的CDK3表达分析。结果：PCR扩增获得约900 bp目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列,全长915 bp;CDK3目的片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP载体,获得相应表达载体;运用构建的表达载体,可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论：成功构建了CDK3系列哺乳动物细胞表达载体,并在NIH3T3中得到表达。