血管紧张素转化酶相关性羧肽酶在人及啮齿动物胰腺的表达

目的近几年发现的血管紧张素转化酶相关性羧肽酶(ACE2),是血管紧张素转化酶(ACE)的相关酶,新近被证实是SARS相关冠状病毒的一个功能性受体。我们的先前实验发现SARS患者的血糖水平比对照组显著升高,提示SARS冠状病毒可能侵袭胰腺并导致胰腺损伤。本文研究ACE2在人、大鼠和小鼠内外分泌腺的表达,为探讨糖尿病及SARS病毒感染后血糖升高的机制提供依据。方法通过免疫组化的方法检测ACE2在人、大鼠和小鼠胰腺的表达。分别提取人和大鼠胰腺组织的RNA,通过RT-PCR的方法检测ACE2在人、大鼠的表达。结果免疫组化:ACE2在人、大鼠、小鼠的胰腺内外分泌腺均有表达,ACE2在内分泌腺的表达均强于外分泌腺。RT-PCR:在人和大鼠的胰腺RNA经逆转录后均扩增出ACE2基因片段,提示ACE2在人和大鼠胰腺中均有表达。结论ACE2在胰腺内分泌腺表达,提示SARS病毒能通过胰岛细胞膜上的ACE2受体侵入胰岛细胞,引起胰岛细胞损伤。     

血管紧张素转换酶2在SARS-CoV感染中的功能(第2部分)--SARS-CoV在ACE2表达细胞中的复制和ACE2基因敲除对小鼠SARS-CoV感染的保护作用

目的研究ACE2在SARS-CoV感染中的作用。方法利用表达人类ACE2的小鼠成纤维细胞系和ACE2基因敲除小鼠研究SARS-CoV在小鼠成纤维细胞中的复制和ACE基因剔除小鼠体内的复制。结果SARS-CoV可以感染，并在表达人类小鼠ACE2的小鼠成纤维细胞中的复制，ACE2基因的缺失严重影响了SARS病毒与组织的结合，和SARS病毒在动物体内的复制，ACE2基因剔除对小鼠SARS—CoV感染具有保护作用。结论ACE2是SARS-CoV的主要受体，并且是SARS治疗潜在的靶基因。     

小鼠ACE2基因的克隆和体外表达以及序列分析与组织分布

目的:深入研究血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在心血管疾病发病机理中的作用及在高血压基因治疗中的应用,克隆和体外表达小鼠ACE2基因,并进行核苷酸和氨基酸序列分析和组织分布特征研究.方法:采用RT-PCR方法,从小鼠肾组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,TA克隆到pGEM-T easy载体,亚克隆到pcDNA3.1 载体,构建重组真核表达质粒pmACE2,测序鉴定.采用脂质体法将pmACE2转染Cos7细胞,分别用RT-PCR和SDS-PAGE检测ACE2的转录和表达.CLUSTALX 1.8生物软件分析小鼠和大鼠及人ACE2蛋白的多序列比较.采用RT-PCR技术研究小鼠ACE2组织分布的特异性.结果:①RT-PCR扩增片段约2.6 kb,重组真核表达质粒pmACE2测序结果表明,克隆片段存在A701G、T1102C和T1330C 3处变异,其序列与以往报道不一致,cDNA全长为2 397 bp,而与NCBI Refseq数据库(XM-136130)中cDNA全长1 902 bp不符;②SDS-PAGE显示pmACE2表达产物的相对分子量约80 kD;③氨基酸序列分析表明,小鼠ACE2主要由N末端的信号肽序列(第1-18位残氨)、含有锌结合位点保守序列HHEMGHIQ(第373-380位残氨)的催化结构域和跨膜结构域(第738-765位残氨)组成;④小鼠ACE2与人有84%的相似性,与大鼠有90%的相似性,三者同源;⑤ACE2在肺、心和肾组织中大量表达,在睾丸和肝组织中也有表达.结论:成功克隆并体外表达了小鼠ACE2基因,不同物种ACE2组织分布的特异性不尽相同.     

醒脑静注射液预处理对七氟烷麻醉小鼠认知功能的影响及其潜在机制研究

目的 探讨醒脑静注射液预处理对七氟烷(sevoflurane)麻醉小鼠认知功能的影响及其潜在机制.方法 用3%七氟烷持续麻醉6 h,模拟七氟烷麻醉的小鼠模型将动物随机分为对照组、模型组、醒脑静组,并于麻醉前2 h分别干预.监测麻醉过程中的血氧饱和度(SPO2)和心率;应用Morris水迷宫实验观察小鼠逃避潜伏期的变化;应用RT-PCR法和免疫印迹法检测大脑海马组织中脑源性神经营养因子(brain derived neurotropic factor,BDNF)的表达水平.结果 监测显示:各组麻醉过程中的SPO2及心率均无统计学差异;Morris水迷宫显示:麻醉后模型组逃避潜伏期显著高于对照组(P<0.01),醒脑静组较模型组显著降低(P<0.05);RT-PCR结果显示:模型组BDNF的mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.01),醒脑静组的表达水平较模型组显著升高(P<0.01);免疫印迹法结果与PT-PCR法一致.结论 醒脑静预处理可改善七氟烷麻醉小鼠导致的认知功能障碍,且通过调节BDNF的表达发挥作用.     

烟雾吸入伤后大鼠肺及肾血管紧张素转换酶表达变化的研究

目的 探讨血管紧张素转换酶(ACE)和ACE2在烟雾吸入伤后大鼠肺、肾的表达变化和可能的作用机制.方法 30只健康雄性sD大鼠随机分为正常对照组,伤后1、4、10和24 h组,每组各6只.致伤组予以浓烟吸人30 min,按组别不同在相应时间点取其肺、肾组织,分别进行肺组织湿/干重测定、HE染色和ACE、ACE2免疫组织化学检测.结果 致伤组大鼠均表现出急性肺损伤症状,肺湿/干重均显著高于正常对照组(P<0.05或P<0.01).ACE、ACE2在正常肺、肾细胞膜上有表达.肺内ACE表达在致伤后立即升高;而肺内ACE2在致伤后4 h开始明显升高.各组间肾组织ACE及ACE2表达无明显差别.结论 肺组织ACE、ACE2表达的不同变化在烟雾吸入伤的发生机制中可能有重要作用.     

慢性宫内缺氧对新生仔鼠胰腺NDUFB6基因启动子区域甲基化的影响

目的 研究慢性宫内缺氧(CIH)新生仔鼠胰腺NDUFB6基因表达及其表观遗传的改变,并探讨其机制。方法 12只妊娠SD大鼠分为健康组和缺氧组,建立CIH模型,2组分娩后2周仔鼠做空腹血糖(FBG)、空腹血胰岛素(FINS)检测;仔鼠麻醉处死,取胰腺,采用免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western blot)检测胰腺组织NDUFB6蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR(qPCR)检测2组仔鼠胰腺组织上NDUFB6 mRNA表达情况;亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)实验检测2组仔鼠胰腺组织NDUFB6基因启动子区域位点甲基化修饰情况。结果 与健康组仔鼠比较,缺氧组仔鼠表现糖耐量异常与胰岛素抵抗现象,仔鼠胰腺组织NDUFB6 mRNA、NDUFB6蛋白表达水平降低(P<0.05),仔鼠胰腺组织NDUFB6基因启动子CpG岛甲基化水平增高(P<0.01)。结论 CIH可致缺氧孕鼠仔鼠胰腺NDUFB6基因发生表观遗传改变,参与CIH后仔鼠胰岛素抵抗的发生、发展过程。     

Spike蛋白B-细胞线性表位多肽在SARS-CoV感染过程中作用的体内研究

目的 明确SARS-CoV Spike蛋白来源的不同B细胞免疫多肽在SARS-CoV感染h-ACE2C57转基因小鼠过程中的作用.方法 用不同B细胞表位多肽S471-503,S604-625,S1164-1119及S597-625单独或联合免疫h-ACE2C57转基因小鼠,检测血清抗体滴度,当血清中的抗体达到有效滴度时,用SARS-CoV感染小鼠,感染后4 d处死小鼠,观察SARS-CoV感染靶器官肺组织的组织形态学变化,应用RT-PCR的方法检测肺组织中SARS-CoV病毒表达量的差异.结果 S471-503,S604-625,S1164-1119这三种多肽联合免疫组的小鼠,肺组织的病理性改变要比0.9%NaCl免疫的对照组轻,PCR结果显示SARS-CoV表达情况减弱,S597-625与S604-625相比,其N端增加了7个氨基酸残基,但S597-625多肽单独免疫小鼠其肺组织病理性改变与对照组相比,程度却出现了抗体依赖的增强作用(antibody dependent enhancement,ADE),RT-PCR结果也显示病毒的表达量有所增强.结论 我们的研究表明,Spike蛋白S1结构域27个氨基酸残基的B细胞线形免疫原S597-625抗体的ADE作用是独立于Fcγ受体之外的.这种非经典ADE作用可以提供更多的研究价值.疫苗是有效抵抗各种感染的工具之一,在我们的研究中,这种ADE现象可以减弱或是平衡掉其他中和抗体的作用.因此,对ADE现象进行认真系统的阐述是非常有必要的,它关系着疫苗安全性问题以及新疫苗在生产过程中的工艺实施问题.     

SARS-COV功能受体hACE2 mRNA在人股骨头中表达的检测

目的 检测人股骨头负重区软骨下松质骨中血管紧张索转化酶2(ACE2)mRNA的有效表达,由此来初步推断重症急性呼吸综合征(SARS)中冠状病毒是否通过S蛋白介导引起骨坏死.方法 取成人正常股骨头负重区软骨下松质骨、软骨、肺组织,以Humanβ-actin基因表达为对照,分别采用RT-PCR方法检测组织中ACE2mRNA的有效表达.结果 在上述各种组织中,只有肺组织能检测到ACE2mRNA的有效表达,股骨头负重区软骨下松质骨、软骨均未能检测到ACE2mRNA的有效表达;3种组织均能检测到Humanβ-actin mRNA的有效表达.结论 SARS冠状病毒不可能通过S蛋白直接作用于股骨头而引起骨坏死,为临床进一步研究SARS患者股骨头坏死的致病机制提供了线索.     

基因枪介导人精子顶体膜相关蛋白32基因疫苗在小鼠骨骼肌中的表达

目的:观察pcDNA3.1( )-人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)基因疫苗经基因枪介导肌肉接种后在小鼠体内的表达.方法:BALB/c雌性小鼠6只,实验组鼠(4只)经后腿股内侧肌以基因枪多点注射重组质粒pcDNA3.1( )-hSAMP32 5μg,空载体对照组(1只)注射pcDNA3.1( )载体5 μg,空白对照组(1只)注射无菌生理盐水200μl.接种后第7 d取小鼠股内侧肌注射部位肌肉,RT-PCR和原位杂交法检测目的基因mRNA的表达,以自制抗血清进行免疫组织化学染色检测目的基因蛋白的表达.取小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎组织,PCR扩增,行基因疫苗的安全性检测.结果:RT-PCR和原位杂交检测结果显示实验组小鼠注射部位肌肉组织有目的基因及其蛋白的表达,对照组未见表达.实验组小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎的基因组DNA均未扩增出目的基因条带,说明外源性基因没有整合到宿主染色体.结论:该基因疫苗可在小鼠骨骼肌内有效、安全地表达.     

功能性Leptin受体mRNA的分布与表达

目的:探讨并证实瘦素(leptin)受体(OB—R)的分布。方法:选取4～6周龄的C57/BL6小鼠15只,手术获取小鼠胰腺、心脏、肝脏、下丘脑等组织,应用免疫组织化学及RT—PCR方法检测OB—R的存在。采用多克隆抗体法和琼脂糖凝胶电泳检测OB—Rb。结果:免疫组织化学方法证实,瘦素受体在C57/BL6小鼠的脑、胰腺、肝脏、心脏、肾脏、脂肪等组织中均有表达,各组织胞     

脂联素通过激活p38MAPK信号通路调节大鼠肝星状细胞MMP-13及TIMP-1表达

目的观察外源性脂联素对体外培养的大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)细胞脂联素受体1(AdipoR1)表达的调节作用及对细胞内p38MAPK信号通路的影响,并观察该通路是否参与调节脂联素对HSC细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响。方法 MTT法观察不同浓度脂联素对HSC生长的影响。荧光定量PCR法检测脂联素作用下HSC-T6细胞AdipoR1、MMP-13、TIMP-1的mRNA表达情况。Western blotting方法检测脂联素作用下HSC-T6细胞信号蛋白p38MAPK的活化及活性和AdipoR1、MMP-13、TIMP-1的蛋白表达情况。结果 0.5μg/mL～2.0μg/mL脂联素处理HSC细胞,各组细胞增生无明显变化。0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL脂联素作用下AdipoR1mRNA和蛋白表达增加。1.0μg/mL脂联素处理HSC后,p38MAPK激酶磷酸化水平随时间增加而增高,在120min达最大值,之后又开始下降。不同浓度脂联素处理HSC120min后,p38MAPK激酶磷酸化水平均增加,并具有浓度依赖性。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制p38MAPK激酶的磷酸化及活性。脂联素处理组HSC细胞MMP-13mRNA及蛋白表达均较对照组明显增加,而TIMP-1mRNA及蛋白表达较对照组降低,而SB203580可以抑制这种效应。结论脂联素可上调活化肝星状细胞AdipoR1的表达,通过激活p38MAPK信号通路,调节HSC细胞MMP-13及TIMP-1的表达。     

大鼠ACE2腺病毒载体的构建及其在INS-1细胞中的表达

目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,将ACE2基因定向克隆到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdxsi载体同源重组后得到携带大鼠ACE2基因的重组腺病毒(pAdxsi-GFP-CMV-ACE2),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外转染INS-1细胞,绿色荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blotting检测ACE2蛋白的表达。结果克隆得到大鼠ACE2基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染INS-1细胞。结论成功构建了表达ACE2的复制缺陷型重组腺病毒,为深入研究ACE2基因在胰岛细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础。     

Claudin-7—潜在的抑癌基因

目的分析Claudin-7基因敲除后小鼠表型及Claudin-7潜在的抑癌功能。方法将小鼠分为2组,Claudin-7基因敲除组及野生型组,每组各15只,分别采用PCR鉴定小鼠基因型,HE染色观察Claudin-7基因敲除后各脏器的组织病理学变化;免疫共沉淀(CO-IP)检测Claudin-7与intergrinα2相互作用;蛋白印迹技术检测Claudin-7在小鼠不同脏器及C-fos、C-jun、Cox-2蛋白在小鼠肠道中表达,同时检测Claudin-7在人不同分化大肠癌及肝转移组织中的表达情况,分正常人大肠组织、高分化大肠癌组织、低分化大肠癌组织及大肠癌肝转移组织4组,每组20例患者。结果 Claudin-7基因敲除小鼠自出生后第4 d左右停止生长,7 d左右死亡;HE染色以肠道病理变化最为显著,表现为黏膜上皮细胞严重脱落、空泡形成、并有炎性反应细胞浸润,其他脏器病理变化显示除有轻微的中性粒细胞浸润外未见明显的组织损伤;Claudin-7在肠道、胃、肺、膀胱、皮肤、胸腺、肾脏脏器中均有表达,小肠和大肠广泛强表达;Claudin-7和intergrinα2免疫共沉淀,C-fos、C-jun及Cox-2蛋白表达在Claudin-7基因敲除小鼠肠道中显著高表达(P<0.001);Claudin-7蛋白表达随大肠癌的分化降低而降低,在大肠癌肝转移组织中表达显著降低(P<0.001),差异有统计学意义。结论 Claudin-7基因敲除可诱导严重的肠道炎性反应,Claudin-7可能为潜在的抑癌基因。     

iNOSmRNA对重症急性胰腺炎大鼠内分泌功能的影响

目的研究重症急性胰腺炎大鼠胰腺内分泌功能的变化,探讨iNOSmRNA在胰腺内分泌功能损伤中的作用。方法制作重症急性胰腺炎大鼠动物模型,对胰腺病理损伤评分;检测脂肪酶、血糖浓度;分离胰岛,进行葡萄糖刺激胰岛素分泌试验;应用逆转录聚合酶链反应技术,检测胰岛iNOSmRNA的表达情况。结果重症急性胰腺炎大鼠病理学评分、血糖、血清脂肪酶升高,葡萄糖刺激胰岛素分泌量较对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);逆转录聚合酶链反应提示重症急性胰腺炎组胰岛的iNOSmRNA表达增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论重症急性胰腺炎对胰腺内分泌功能有较大影响,iNOSmRNA在其中发挥作用。     

大鼠肾脏α_1-肾上腺素受体和血管紧张素Ⅱ受体亚型表达水平随增龄的改变

目的研究α1-肾上腺素受体(α1-adrenergic receptor,α1-AR)和血管紧张素Ⅱ受体(angiotensinⅡreceptor,ATR)各亚型在增龄过程中蛋白水平的变化。方法采用蛋白质免疫印迹(Western blotting)分别对3月龄(青年组)、12月龄(中年组)、18月龄(老年前期组)和24月龄(老年组)Wistar大鼠肾脏α1-AR和ATR亚型蛋白水平进行测定。结果在α1-AR的亚型中,α1A-AR的表达水平随增龄逐渐下调(P<0.01);α1B-AR和α1D-AR的表达在各年龄组差异无统计学意义。在ATR的亚型中,AT1R表达水平在老年前期组和老年组均较青年组显著下调(P<0.01),中年组与青年组相比差异无统计学意义;AT2R的表达水平在老年组较青年组显著上调(P<0.01),青年组、中年组和老年前期组之间差异无统计学意义。结论肾脏α1-AR和ATR的表达水平随增龄而变化,α1A-AR的下调可能与肾脏在衰老过程中的功能减退相关;AT1R下调可能有利于肾脏在衰老过程中维持其正常的生理功能;AT2R在老年期表达上调,有利于拮抗AT1R的作用、消除随增龄出现的血管收缩功能增强的不利影响。     

特异性小干扰RNA抑制诱骗受体3在结肠癌SW480细胞表达的研究

目的研究特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)基因在人结肠癌SW480细胞系中的抑制作用。方法设计特异性的DcR3 siRNA序列;构建DcR3的pSUPER表达质粒并鉴定,鉴定成功后用于转染SW480细胞。以RT-PCR的方法检测细胞转染后DcR3 mRNA的表达;以Western blotting的方法检测DcR3蛋白的表达情况,并作统计学处理。结果与对照组相比,本实验设计两段siRNA对SW480细胞中DcR3 mRNA及蛋白表达的抑制作用明显,实验细胞DcR3 mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.01)。结论针对DcR3的siRNA质粒转染真核细胞后可抑制其mRNA及蛋白表达,为进一步探讨DcR3的功能及封闭DcR3基因表达而治疗肿瘤奠定了实验基础。     

哮喘小鼠肺脏组织肾素-血管紧张素系统相关组分表达 及AT1R拮抗剂对其影响

目的：探讨肾素-血管紧张素系统（RAS）与哮喘发生的关系,为哮喘发病机制的研究和治疗提供理论依据。方法：复制小鼠哮喘模型,小鼠分为对照组、模型组、坎地沙坦低剂量组及高剂量组,采集小鼠血清,测量血清中血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)与血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)的含量;通过Western blotting和RT-PCR观察RAS中血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转换酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ 1型受体（AT₁R）和2型受体（AT₂R）在各组小鼠肺组织中的表达。结果：模型组小鼠血清AngⅡ含量较对照组增高（P<0.05）,坎地沙坦组与模型组比较无明显变化（P>0.05）。各组小鼠血清中AngⅠ含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。模型组小鼠AT1R和ACE蛋白表达较对照组明显增加（P<0.05）,坎地沙坦组AT₁R表达与模型组比较明显降低(P<0.05),ACE无明显变化（P>0.05）。AT₂R蛋白表达各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。模型组小鼠ACE mRNA表达较对照组明显增加（P<0.05）,坎地沙坦组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。模型组小鼠AT1R mRNA表达较对照组明显增加（P<0.05）,坎地沙坦组较模型组明显降低（P<0.05）。模型组AT2R mRNA较对照组明显降低（P<0.05）,坎地沙坦组较模型组明显增加（P<0.05）。各组AGT mRNA表达无明显变化（P>0.05）。  结论：在小鼠哮喘发病过程中,RAS活化参与了哮喘的发病过程,并且AT₁R拮抗剂坎地沙坦可以逆转ACE、AT₁R和AT₂R表达的改变。     

2型糖尿病肾病大鼠肾小管间质病变及TGF-β1、HGF和CTGF表达的变化及意义

目的通过2型糖尿病肾病(T2DN)大鼠模型,探讨早期糖尿病肾病(DN)肾小管间质的病理变化及转化生长因子β1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)和结缔组织生长因子(CTGF)表达变化及意义。方法高热量饲料喂养加腹腔注射链脲佐菌素(STZ),复制T2DN模型。14周和20周时用HE染色及PASM染色方法观察肾小管及间质的病理变化;用免疫组织化学的方法观察肾小管间质中TGF-β1、HGF和CTGF的表达变化,并进行半定量分析。结果模型组大鼠具有血糖异常、胰岛素抵抗及肾小球高滤过率、白蛋白尿等特点;部分肾小管上皮细胞萎缩、脱落、空泡化,基底膜增厚及小管间质纤维化。免疫组织化学方法提示TGF-β1和HGF14周及20周时在2组大鼠小管间质的表达差异有统计学意义(P<0.01);CTGF在2组大鼠肾小管间质有少量表达,差异无统计学意义。结论早期DN大鼠模型中肾小管间质已开始出现纤维化改变;TGF-β1、CTGF和HGF在早期DN的肾小管及间质中的表达发生变化,提示TGF-β1、CTGF和HGF在肾小管间质的表达失衡与DN肾小管病变的进展相关。