自噬在人肝癌细胞Huh7对仑伐替尼耐药中的调节作用

目的 研究自噬在人肝癌细胞Huh7对仑伐替尼耐药中的调节作用。方法 以人肝癌细胞Huh7为对象,采用低浓度逐渐递增联合长期给药的方式构建仑伐替尼耐药细胞模型Huh7-LR,以CCK-8实验和流式细胞术检测亲本细胞Huh7及耐药细胞Huh7-LR对仑伐替尼的敏感性,以Western blot实验和GFP-mCherry-LC3质粒转染实验分别检测细胞中自噬效应蛋白Beclin-1、自噬接头蛋白sequestosome 1（又名p62）、微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达水平和细胞自噬水平。通过饥饿诱导构建自噬激活细胞模型,以Western blot实验和GFP-mCherry-LC3质粒转染实验分别检测细胞中p62蛋白表达水平和细胞自噬水平,以流式细胞术检测自噬激活对仑伐替尼敏感性的影响。结果 与亲本细胞相比,Huh7-LR细胞的耐药指数为6.2,其p62蛋白的表达水平显著升高,凋亡率、Beclin-1蛋白的表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著降低（P<0.05或P<0.01）,自噬水平有所下降。自噬激活可显著升高Huh7-LR细胞中p62蛋白的表达水平（P<0.0...     

人源性及牛源性乳铁蛋白抑制丙型肝炎病毒复制作用的对比研究

目的：探讨人乳铁蛋白(HLF)及牛乳铁蛋白(BLF)在体外HepG2细胞中对丙型肝炎病毒(HCV)感染增殖的抑制作用，为乳铁蛋白用于临床治疗HCV感染提供理论和实验依据。方法：以HepG2细胞作为HCV复制体系，以RT nPCR方法，测定培养细胞提取物中病毒正、负链，并用活性细胞定量鉴定法(MTT)对两种乳铁蛋白的细胞毒性作用及药物剂量进行研究。结果：细胞毒实验显示，实验中两种乳铁蛋白的浓度小于1.5 mg·mL 1时对HepG2细胞生存率无显著影响。HCV阳性血清接种HepG2细胞后，HCV正、负链可于第8，10，12天被检测到。当两种乳铁蛋白(浓度分别为1.5，1.0，0.5，0.1 mg·mL 1)先与HCV阳性血清作用后再接种细胞时，不同时期提取物中均未测定到HCV正、负链。而当乳铁蛋白(浓度同上)先与细胞作用后洗去再与HCV阳性血清作用时，不同时期细胞提取物中可测定到HCV正、负链。结论：乳铁蛋白能在非细胞毒性剂量时能防止HCV感染HepG2细胞；乳铁蛋白可能主要是通过与病毒颗粒本身相互作用发挥上述功能；两种来源的乳铁蛋白在体外抑制HCV复制的作用差异无显著性。     

干扰素诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶体外抗乙型肝炎病毒活性的研究

目的构建表达双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)融合绿色增强荧光蛋白(p EGFP-PKR)真核表达质粒,并进一步研究PKR蛋白在体外抗乙型肝炎病毒(HBV)活性。方法以p EGFP-N1为空载体,运用分子克隆技术构建重组质粒p EGFP-PKR,通过双酶切和直接测序两种方法验证重组质粒p EGFP-PKR是否构建成功。以能分泌完整HBV病毒颗粒子的肝胚瘤细胞株Hep G2.2.15细胞为细胞模型,采用重组质粒转染方式处理Hep G2.2.15细胞,运用荧光显微镜观察融合蛋白p EGFP-PKR在细胞内的表达,以电化学发光方法和实时荧光定量PCR技术分析细胞上清HBV抗原表达和细胞病毒复制水平。结果酶切鉴定和序列分析证实成功构建重组质粒p EGFP-PKR,转染Hep G2.2.15细胞后在荧光显微镜下可见融合蛋白p EGFP-PKR表达,同时细胞分泌的HBV抗原与空载体组相比较明显下降(P<0.05),而细胞外HBV复制水平未见明显变化。结论在体外肝细胞模型中,PKR蛋白具有一定的抗HBV活性作用。     

丙型肝炎的发病机制

实验证明 ,HCV感染后 ,即可表现为急性肝炎 ,也可表现为慢性携带状态 ,慢性迁延性肝炎 ,慢性活动性肝炎和肝硬变 ,甚至肝癌。对这种临床表现复杂 ,慢性化倾向高 ,中和抗体水平低或不产生 ,并与原发性肝癌有较为密切关系的疾病 ,发病机制的研究应引起重视。1　直接致病作用丙肝患者血清 HCV- RNA含量和 AL T呈正相关 ,说明病毒的复制常伴随肝损伤 [1 ]。丙肝患者血浆 ,外周血单个核细胞中仅存在正链 HCV- RNA,而肝细胞中除正链HCV- RNA外 ,还存在着复制中间体即负链 RNA,提示肝细胞是 HCV复制的主要场所 ,也是肝细胞损害的重要原…     

新的抗病毒核苷类似物替比夫定体外对乙型肝炎病毒复制子的抑制作用

目的：观察新的抗乙型肝炎病毒（HBV）核苷类似物——替比夫定体外对乙型肝炎病毒复制子的抑制作用。方法：将乙型肝炎病毒复制子pHBV1．3质粒转染Huh7细胞，在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定，然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，荧光定量PCR（FQ-PCR）定量检测培养上清中HBVDNA拷贝数，Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果：替比夫定减少了培养上清中HBSAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数，抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论：替比夫定在体外对HBV复制有较强的抑制作用。     

lncRNA OSER1-AS1和miR-373-3p在动脉粥样硬化患者中的表达及对AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)氧化应激反应丝氨酸丰富1反义RNA 1(OSER1-AS1)和miR-373-3p在动脉粥样硬化(AS)患者血清、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人主动脉血管平滑肌细胞(HASMCs)中的表达及其对AngⅡ诱导HASMCs增殖与迁移的影响。方法 以41例体检健康者为对照,采用RT-qPCR法测定41例AS血清中OSER1-AS1、miR-373-3p表达。体外培养HASMCs,经1×10^-7 mol/L AngⅡ干预24 h后,采用RT-qPCR法测定细胞中OSER1-AS1、miR-373-3p表达。分别转染OSER1-AS1小干扰RNA、miR-373-3p模拟物或共转染OSER1-AS1小干扰RNA与miR-373-3p抑制剂至HASMCs,再用1×10^-7 mol/L AngⅡ干预24 h,采用CCK-8法、Transwell小室实验分别测定细胞增殖活性和迁移情况,采用Western blot法测定增殖、迁移相关蛋白表达。采用双荧光素酶报告基因实验测定OSER1-AS1与miR-373-3p的靶向...     

BMP-2 通过BMP/Smad/ID3 通路调控非小细胞肺癌 A549细胞的凋亡

目的探讨BMP-2通过BMP通路调控非小细胞肺癌A549细胞凋亡的作用机制。方法通过双酶切/连接克隆的方法,构建BMP-2 siRNA慢病毒载体及BMP-2慢病毒载体并进行包装;转染慢病毒后,采用荧光显微镜对转染效率进行定性分析,流式细胞术对转染率进行定量分析,RT-qPCR和Western blotting检测BMP-2基因的表达,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡蛋白的表达水平以及A549细胞中Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)和ID3蛋白的表达水平。结果转染后第3、4 d,BMP-2 siRNA可显著抑制A549细胞的增殖(P<0.05);转染后24 h,BMP-2 siRNA可显著诱导A549细胞的凋亡(P<0.05),且活化的凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3的表达水平显著升高(P<0.05),而过表达ID3可抑制BMP-2 siRNA对细胞凋亡的诱导作用。与未处理组和阴性对照组相比,BMP-2过表达组细胞中p-Smad1/5/8表达水平显著上调(P<0.05),而Smad1/5/8总蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),ID3蛋白的表达显著上调(P<0.05)。结论BMP-2可通过BMP/Smad/ID3通路参与调控A549细胞的增殖和凋亡。     

微小 RNA-338-3p靶向调控高迁移率族蛋白 B1增强子宫内膜癌对紫杉醇敏感性的研究

目的 探讨miR-338-3p靶向调控高迁移率族蛋白B1(HMGB1)影响子宫内膜癌对紫杉醇(Paclitaxel,PTX)敏感性的分子机制.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白印迹法(Western blottingting)检测miR-338-3p和HMGB1在子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1B中的表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-338-3p和HMGB1之间的靶向关系;将Ishikawa和HEC-1B细胞分为如下5组:miR-338-3p组(转染miR-338-3p mimics组)、miR-NC组(转染miRNA阴性对照组)、si-HMGB1组(转染干扰RNA)、si-NC组(转染siRNA阴性对照)、miR-338-3p+HMGB1组(共转染miR-338-3pmimics和pcDNA3.0 HMGB1组).将各组用转染试剂转染至细胞,用不同浓度的PTX处理上述转染组细胞,CCK-8法检测Ishikawa和HEC-1B细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡,Western blotting检测HMGBI蛋白表达.结果 与人正常子宫内膜上皮细胞ESC相比,miR-338-3p在子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1B中表达下调[(1.00±0.10)比(0.51±0.04)、(0.46±0.04)],而HMGB1则相反;miR-338-3p靶向并负性调节HMGB1表达;过表达miR-338-3p抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1B增殖,促进凋亡,增加其对PTX敏感,与敲低HMGB1结果一致;HMGB1可部分逆转miR-338-3p对子宫内膜癌细胞增殖,凋亡以及对PTX敏感性的影响.结论 miR-338-3p通过负性调控HMGB1抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1B增殖,促进凋亡和增强其对PTX敏感性.     

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响

目的构建LV5-h Cx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响。方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-h Cx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度。将慢病毒载体LV5-h Cx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFPh Cx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×10¹¹TU·L^-1的重组慢病毒LV5-GFP-h Cx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ。过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力。     

蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响及机制研究

摘要：目的:探讨蛇床子素对人肝癌Huh7细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响,并初步探究其作用机制。方法:采用不同浓度(0,2.5,5,10,20,40μg·ml-1)的蛇床子素干预人肝癌Huh7细胞,噻唑蓝（MTT）法检测蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖的影响,并计算半数抑制浓度(IC50);10μg·ml-1蛇床子素联合不同照射剂量（0,2,4,6,8 Gy）的X射线处理Huh7细胞,MTT检测细胞增殖能力,筛选照射剂量;克隆形成实验检测Huh7细胞放射敏感性变化,分别采用10μg·ml-1蛇床子素、4 GyX射线照射及两者联合干预Huh7细胞,流式细胞术检测Huh7细胞凋亡率,Western Blot检测Huh7细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cleaved caspase-9）的表达水平。结果:蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖有明显抑制作用,IC50为20.14μg·ml-1;与单纯照射组相比,蛇床子素联合不同剂量X射线照射下均能够明显抑制细胞存活率,筛选出4 Gy剂量用于后续放射实验。与单纯照射组相比,蛇床子素联合照射组Huh7细胞的放射敏感性、Huh7细胞凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达显著升高（P<0.05）。结论:蛇床子素能够抑制肝癌Huh7细胞增殖,促进细胞凋亡,并增强细胞对放射的敏感性,其作用机制可能与蛇床子素上调cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达有关。     

慢性丙肝患者干扰素治疗血清中丙肝病毒负链RNA的检测及临床意义

利用套式逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）方法，对17例慢性丙肝患者进行了血清丙肝病毒正、负链RNA的检测，并且动态观察了其对干扰素治疗的反应。结果发现治疗前17例患者血清中正链RNA均阳性，13例血清负链RNA亦阳性（反应组8例，无反应组5例）。治疗后反应组中4例血清正链RNA阴转，3例负链RNA阴转；无反应组中血清正、负链RNA状况无变化。提示患者血清中有正、负链RNA复制复合体存在，体内有活跃的病毒复制；干扰素对丙肝病毒及复制活动有抑制作用。负链RNA作为病毒复制活动的直接标志，对评估和预测丙肝治疗的疗效有一定的意义。     

抗丙型肝炎药 Boceprevir

全球丙型肝炎病毒（HCV）感染者约有1．7亿之多，若不及时治疗，可发展为慢性肝炎，并可导致肝硬化、肝衰竭或肝细胞癌。HCV为一种包膜正链RNA病毒，一旦进人适宜的宿主细胞，其基因组便作为模板，翻译一个含3000个氨基酸的多聚蛋白，此蛋白经宿主和被命名为NS3的病毒编码的蛋白酶水解成熟。NS3与可增强酶活性的一种必需辅助因子——NS4A蛋白形成异二聚体复合物，作用于多聚蛋白的非结构部分。此外，NS3还可直接破坏宿主细胞，抑制其对于扰素的应答。     

HCV-F基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

探讨丙型肝炎病毒(HCV)F基因对PI3K表达的影响.应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得HCV-F基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定,HCV-F基因已正确插入到pcDNA3.0(-)中,再利用脂质体转染HepG2细胞.经RT-PCR及Western blot检测,HCV的F基因在HepG2细胞中获得表达,而且在表达重组HCV-F的转染HepG2细胞中,检测到PI3K蛋白的表达.实验表明HCV-F可在体外激活PI3K及其信号通路.     

冬凌草甲素抑制HCT116细胞增殖与p38 MAPK信号通路相关性研究

目的 研究冬凌草甲素（ORI）对人源结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用,并探讨其可能的分子机制。方法 采用结晶紫染色研究ORI （5、10、15、20、25 μmol/L）对HCT116细胞的增殖抑制作用;采用Western blotting技术研究ORI （10、15、20 μmol/L）对HCT116细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、凋亡相关指标（Caspase-3和Cleaved-caspase-3）、p38 MAPK信号通路相关指标（Smad1/5/8、p-Smad1/5/8、p38、p-p38）蛋白表达的影响;采用Western blotting、凝胶电泳技术分析ORI对BMP7蛋白、mRNA表达的影响;转染重组BMP7腺病毒（AdBMP7）实现BMP7的外源性过表达,应用BMP7抗体（anti-BMP7）降低BMP7水平,检测ORI是否通过调节BMP7表达影响HCT116细胞增殖凋亡、p38 MAPK信号通路。结果 与对照组比较,ORI明显抑制HCT116细胞增殖,下调PCNA蛋白水平;明显上调Caspase-3、Cleaved caspase-3、p-p38蛋白表达,且呈浓度与时间相关性,对Smad1/5/8、P-Smad1/5/8蛋白表达无明显影响;明显上调BMP7蛋白及RNA表达;外源性过表达BMP7加强了ORI对上述蛋白表达的调控,anti-BMP7则部分抑制了ORI的作用。结论 ORI抑制HCT116细胞的增殖,其机制可能与上调BMP7蛋白表达进而激活p38 MAPK信号通路相关。     

长链非编码 RNA膀胱癌相关转录物 1对微小 RNA-503-5p的靶向关系及对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究长链非编码RNA(lncRNA)膀胱癌相关转录物1(BLACAT1)对微小RNA(miR)-503-5p的靶向关系及结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结肠癌细胞株SW620,LOVO,HT29和人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460中BLACAT1和miR-503-5p的表达.在HT29细胞中转染si-BLACAT1、pcDNA-BLACAT1或miR-503-5p,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved PARP)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved caspase-3)的表达,starbase预测和双荧光素酶报告分析BLACAT1与miR-503-5p之间的靶向关系.si-BLACAT1和anti-miR-503-5p共转染,观察干扰miR-503-5p对沉默BLACAT1诱导的结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响.结果 与NCM460细胞比较,SW620、LOVO和HT29中BLACAT1表达量明显增加[(4.93±0.58)、(5.66±0.53)、(6.17±0.66)比(1.03±0.22)],miR-503-5p表达量减少[(0.72±0.11)、(0.67±0.09)、(0.51±0.08)比(1.04±0.14)](P<0.05).沉默BLACAT1或转染miR-503-5p明显减少HT29细胞的细胞存活率、Ki-67、CyclinD1蛋白表达量,提高细胞凋亡率、Cleaved PARP和Cleaved caspase-3蛋白水平(P<0.05),过表达BLACAT1则反之.BLACAT1靶向miR-503-5p调控其表达.干扰miR-503-5p部分逆转沉默BLACAT1抑制结直肠癌细胞增殖、Ki-67、CyclinD1蛋白表达和诱导结直肠癌细胞凋亡、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3蛋白表达的作用.结论 lncRNA BLA-CAT1在表达上调,沉默BLACAT1可通过靶向调控miR-503-5p的表达,来抑制结直肠癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

TIP30基因表达对人多发性骨髓瘤细胞生物学功能的影响

目的　研究TIP30 基因表达对人多发性骨髓瘤U266 细胞增殖、凋亡等生物学功能的影响,以期为多发性骨髓瘤临床防治及药物研制提供新的靶点。方法　人多发性骨髓瘤U266 细胞中TIP30 基因过表达采用腺病毒转染法,使用实时定量PCR 和Western blotting 验证TIP30 过表达的效果,分别采用MTT 法、划痕试验检测细胞增殖、迁移情况,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blotting 分析p53、Bax、Bcl-2 蛋白表达。结果　TIP30 过表达腺病毒转染后,过表达组中U266 细胞TIP30基因mRNA 和蛋白表达水平均显著上升。与对照组比较,TIP30 过表达后,细胞增殖、体外迁移能力均显著减弱（P<0.05）;TIP30 过表达后U266 细胞凋亡率较对照组显著增大,TIP30 过表达促进U266 细胞凋亡与上调p53、Bax 蛋白表达,下调Bcl-2 蛋白表达水平相关。结论　TIP30 基因过表达可抑制人多发性骨髓瘤U266 细胞增殖活性与体外迁移能力,并促进多发性骨髓瘤细胞凋亡。     

微小 RNA-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子 4基因抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的 探讨微小RNA(miR)-7-5p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及锌指蛋白核转录因子4(KLF4)基因表达调控的影响.方法 研究起止时间为2018年3—10月.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-7-5p在人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF及口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量.将miR-7-5p模拟物(miR-7-5p mimics)及阴性对照序列(mimics Control)分别转染至SCC25细胞,分为三组:Control组(未转染的SCC25细胞)、NC组(转染mimics Con-trol的SCC25细胞)、miR-7-5p组(转染miR-7-5p mimics的SCC25细胞).以qRT-PCR检测miR-7-5p在SCC25细胞中的转染效果;MTT法检测miR-7-5p对SCC25细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-7-5p对SCC25细胞凋亡的影响;通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测miR-7-5p对KLF4的靶向关系.结果 miR-7-5p在3种口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量[(0.21±0.02)、(0.43±0.04)、(0.48±0.05)]明显低于人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF(1.00±0.09)(P<0.05);转染miR-7-5p mimics能够上调SCC25细胞中miR-7-5p的表达(P<0.05);miR-7-5p过表达能够明显抑制SCC25细胞增殖能力[Control组、NC组72 h吸光度(1.43±0.13)、(1.46±0.15)比miR-7-5p组(0.81±0.09)](P<0.05),并诱导细胞凋亡[Control组、NC组凋亡率(9.48±2.65)％、(10.21±3.02)％比miR-7-5p组(24.41±8.15)％](P<0.05);双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-7-5p过表达可抑制KLF4-Wt报告基因载体细胞相对荧光活性;qRT-PCR和Western blotting进一步证实了miR-7-5p能够靶向调节KLF4 mRNA和蛋白表达.结论 miR-7-5p直接靶向调控KLF4基因的表达来抑制口腔鳞状细胞癌SCC25细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

分别检测HAV两条互补RNA链

甲型肝炎病毒（HAV）是单股正链RNA病毒。HAV感染细胞脱壳后,RNA直接翻译为一个多蛋白,然后裂解为不同的结构和非结构蛋白,依赖病毒RNA的RNA聚合酶将基因组进行拷贝,产生由正链和负链RNA构成的增殖性中间体,负链又作为模板合成正链RNA,正链RNA装配上核壳成为新的病毒颗粒,而不再作为负链合成的模板。因此,负链RNA的量在HAV整个增殖周期中是非常低的,据估计不超过全部HAV RNA量的0.02％,但早期检测负链RNA,可以了解HAV的增殖,环境标本的HAV感染性,同时还可用于研究抗病毒物质在HAV生长     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。