激活星形胶质细胞α7乙酰胆碱能受体抑制β-淀粉样蛋白的聚集

目的研究在星形胶质细胞内加入尼古丁后能否激活细胞内α7尼古丁乙酰胆碱能受体(n AChR)以及激活的α7n AChR对β-淀粉样蛋白(Aβ)的降解作用。方法分离新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并纯化、传代,使用细胞免疫荧光法鉴定细胞的纯度。凝胶银染方法鉴定寡聚体聚集情况。试验分为正常对照组、激动剂组、拮抗剂组以及Aβ组激动剂+Aβ组、拮抗剂+Aβ组,用蛋白印迹法检测α7n AChR蛋白表达情况以及激活细胞内受体后对Aβ的降解作用。结果经过传代培养细胞得以纯化。体外制备好的Aβ1~42除了含少量的未聚集的单体(4 k D)外,主要以二聚体、三聚体、九聚体等不同聚集形式的寡聚体存在。尼古丁组与对照组相比α7n AChR表达明显升高(P0.01),尼古丁组与拮抗剂组相比α7n AChR表达升高(P0.05);收集的蛋白与上清液,尼古丁组与Aβ组相比Aβ的表达均明显降低(P0.01),激动剂+Aβ组与拮抗剂+Aβ组相比Aβ的表达均明显降低(P0.01)。结论尼古丁可以激活星形胶质细胞内的α7n AChR,激活的α7n AChR对Aβ具有明显的降解作用,能够为预防和治疗阿尔茨海默氏病(AD)提供一个可能的方向。     

促红细胞生成素对星形胶质细胞损伤的保护作用

目的探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的星形胶质细胞的作用。方法采用出生3 d内的SD大鼠大脑制成细胞悬液后,在含15%胎牛血清的DMEM培养液中培养,通过摇床和逐渐传代纯化星形胶质细胞,分为正常组、正常E组（正常细胞＋EPO 10 U/L）、损伤组（缺氧3 h）、损伤E组（损伤细胞＋EPO 10 U/L）。用免疫荧光技术鉴定星形胶质细胞,MTT法检测细胞活性和凋亡情况,PCR技术测定细胞纤维酸性蛋白（GFAP）。结果星形胶质细胞摇床后传至第3代,经鉴定其星形胶质细胞纯度达95%以上;缺营养3 h后部分细胞形态变圆甚至死亡,漂浮在正常细胞表面;正常E组和损伤E组细胞在分别加入EPO 3 d后,损伤E组细胞活性与GFAP表达均明显升高,正常E组则没有明显变化。结论EPO对缺营养损伤的星形胶质细胞有显著的保护作用,而对正常星形胶质细胞无保护作用。     

HCMV感染对人原代星形胶质细胞IL-6和IL-8表达的影响

目的观察人巨细胞病毒(HCMV)感染时人原代星形胶质细胞分泌的IL-6和IL-8的表达变化。方法分离纯化人原代星形胶质细胞并用免疫荧光法鉴定纯度。用HCMV感染原代星形胶质细胞制作HCMV感染模型,采用RT-PCR及免疫荧光法检测感染后星形胶质细胞中的即刻早期(IE)mRNA和蛋白的表达(进行模型鉴定)。RT-PCR及Western blot法检测正常培养和感染HCMV的人原代星形胶质细胞中IL-6和IL-8 mRNA和蛋白的表达。结果 HCMV能够感染人原代星形胶质细胞。正常培养的人原代星形胶质细胞能够表达IL-6 mRNA和蛋白,但不表达IL-8;HCMV感染初期的人原代星形胶质细胞中IL-6 mRNA和蛋白均表达增加,IL-8表达被激活(P均<0.05),而感染后期两种因子的表达明显下调。结论 HCMV感染能够诱导人原代星形胶质细胞IL-6和IL-8的表达异常。     

小胶质细胞α7-nAChR表达及意义

目的观察巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体（α7-nAChRR）在体外培养的小胶质细胞中的表达,为进一步研究其作用提供理论依据。方法采用RT-PCR及细胞免疫荧光双标法,用针对α7-nAChRR特异性的引物进行PCR,分析α7-nAChRR在小胶质细胞中的表达。结果可扩增出450 bp目的条带;细胞免疫荧光双标分析显示,小胶质细胞抗CD11b/c和抗α7-nAChRR染色均呈阳性。结论α7-nAChRR在体外小胶质细胞中能正常表达;此可能是小胶质细胞发挥作用的分子学基础。     

星形胶质细胞缺氧缺糖后PKC PKA PKG CaMKⅡ表达的变化及对AQP4的影响

目的探讨星形胶质细胞在缺氧、缺糖情况下蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶G(PKG)及钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达变化情况。方法取2 d龄新生SD大鼠的大脑皮层进行星形胶质细胞的纯化与培养,通过缺氧、缺糖处理建立缺血细胞模型。以实验处理方式的不同分为对照组和模型组,通过RT-PCR法检测星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达的变化,采用Western blot法检测星形胶质细胞PKC、PKA、PKG和CaMKⅡ的表达情况。比较两组各项指标的差异。结果模型组的AQP4表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。模型组的PKC表达水平低于对照组,CaMKⅡ表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。PKA、PKG的表达水平在两组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论缺氧、缺糖导致的星形胶质细胞的PKC表达水平下降及CaMKⅡ表达水平升高,可能与星形胶质细胞水肿有关。     

姜黄素对Aβ诱导的老年痴呆大鼠海马胶质纤维酸蛋白表达的影响

目的通过观察姜黄素对Aβ1～40诱导的阿尔茨海默病(AD)大鼠空间学习记忆能力及海马区星形胶质细胞胶质纤维酸蛋白(GFAP)表达的影响,探讨姜黄素的作用机制。方法选择健康SD大鼠48只,分为空白对照组、AD对照组、姜黄素给药组,每组16只。Aβ1～40诱导大鼠认知障碍模型,采用Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力。采用免疫组织化学方法检测GFAP蛋白表达,RT-PCR检测GFAP mRNA表达。结果姜黄素干预后AD大鼠空间学习记忆能力明显改善(P<0.05);与空白对照组相比,AD对照组大鼠脑组织海马区可见星形胶质细胞GFAP表达明显增多(P<0.05),姜黄素给药组大鼠脑组织海马区GFAP mRNA及免疫阳性细胞表达较AD对照组下降(P<0.05)。结论姜黄素能够改善Aβ1～40诱导的AD模型大鼠空间学习记忆障碍,其机制可能与降低GFAP的表达和抑制星形胶质细胞活性有关。     

SD大鼠肺成纤维细胞的原代培养及分离纯化

目的建立大鼠肺成纤维细胞的体外高效稳定的培养方法。方法取成年SD大鼠,采用差速贴壁法纯化与胰酶反复消化法传代,得到纯度更高产量更多的肺成纤维细胞。所得细胞采用免疫细胞化学方法加以鉴定,且进行生长曲线测定。结果肺成纤维细胞纯化率可达99.3%,细胞增殖快,生长良好,产量大。结论成功建立了肺成纤维细胞纯化与传代的方法,适用于细胞水平上的间质性肺病发病机制的研究。     

雌激素对Aβ1-40诱导大鼠星形胶质细胞和NOS阳性细胞变化的影响

目的 探讨雌激素对淀粉样β蛋白诱导大鼠星形胶质细胞及NOS阳性细胞变化的影响.方法 于雄性SD大鼠双侧海马注射Aβ1～40,制作AD大鼠病理模型,颈部皮下植入E2,60 d后取脑行冻切片.采用组化和免疫组化方法,观察大鼠海马GFAP与NOS阳性细胞表达的变化,以及雌激素对上述指标的影响.结果 AD大鼠出现海马星形胶质细胞增生、肥大,数量明显多于正常对照组（P＜0.05）,并出现一氧化氮阳性星形胶质细胞;海马一氧化氮神经元数量较正常对照组显著减少（P＜0.05）.E2处理组星形胶质细胞增生不明显,数量明显少于AD模型组（P＜0.05）,且未见一氧化氮阳性星形胶质细胞;海马一氧化氮神经元数量较AD模型组显著增加（P＜0.05）.结论雌激素可减轻神经系统的损伤,对AD有一定防治作用,但其作用机制尚需进一步探讨.     

窖蛋白1对大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的影响

目的探讨糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)对体外培养的大鼠星形胶质细胞窖蛋白1(caveolin-1,Cav-1)的影响。方法原代培养出生24h内SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为对照组和OGD组(给予星形胶质细胞6h的OGD和24h的再灌注损伤,建立OGD损伤模型)。用多重免疫荧光的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达,实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达的变化。根据小干扰RNA(siRNA)的原理,将Cav-1siRNA转染星形胶质细胞,采用CCK-8的方法检测星形胶质细胞活力。结果大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1普遍表达。与对照组比较,OGD组星形胶质细胞Cav-1mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05)。siRNA转染后,与对照组比较,OGD组星形胶质细胞活力下降(P<0.05)。结论 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1表达的下调,导致OGD后细胞损伤加重,提示Cav-1对星形胶质细胞具有保护作用。     

参麦注射液对大鼠神经元内质网应激诱导凋亡的影响

目的 探讨参麦注射液对大鼠皮层神经元内质网应激诱导凋亡的保护作用.方法 体外培养SD乳鼠皮层神经元细胞,免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度,流式细胞术AnnexinV、PI双标检测凋亡率及活性caspase-3、-9表达,Western印迹免疫分析GRP78、细胞色素C蛋白、Bcl-2蛋白表达,Fura-2/AM法荧光分光光度计检测细胞内钙浓度([Ca~(2+)]i).结果 SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养,2 μmol/L毒胡萝卜素作用神经元24、48 h细胞凋亡率分别是17.88%、21.38%,参麦治疗组分别是7.42%、8.16%,两组差异显著(P<0.05).胡萝卜素诱导神经元糖调节蛋白GRP78表达上调,活化caspase-3、-9,使细胞色素C蛋白表达增加,Bcl-2表达减少.参麦注射液促进细胞Bcl-2表达,抑制细胞色素C释放,减少活性caspase-3、-9含量,降低[Ca~(2+)]i浓度.结论 参麦注射液能抑制体外培养神经元内质网应激所致的凋亡可能与其降低[Ca~(2+)]i浓度有关.     

慢病毒转染基质金属蛋白酶9对星形胶质细胞水通道蛋白4表达的研究

目的观察慢病毒转染基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)后,星形胶质细胞水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)表达变化,探讨慢病毒转染星形胶质细胞的可行性。方法取出生2d的SD乳鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯化培养,利用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的慢病毒转染细胞,通过倒置荧光显微镜观察细胞内GFP显影效果。将细胞分为正常组、阴性对照组[转染小干扰RNA(siRNA)]和MMP-9慢病毒组(转染MMP-9siRNA),用RT-PCR检测MMP-9 mRNA和AQP4 mRNA表达变化。结果 MMP-9慢病毒组细胞增殖较快,第3天细胞内GFP在倒置荧光显微镜显影90%,到达80%左右转染率的最佳感染条件为复感染指数=30～50。正常组MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达为0.982±0.169和1.095±0.035,阴性对照组分别为1.104±0.271,1.112±0.026,MMP-9慢病毒组表达分别为0.552±0.197和0.652±0.042。正常组与阴性对照组MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达比较,差异无统计学意义(P0.05);与阴性对照组和正常组比较,MMP-9慢病毒组细胞MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论慢病毒转染星形胶质细胞MMP-9可介导AQP4表达下调,为进一步利用星形胶质细胞进行缺血性脑水肿基因调节的研究提供实验依据。     

微小隐孢子虫IId亚型早期感染对HCT-8细胞TLRs的影响

目的 研究微小隐孢子虫IId亚型(中国流行株)感染对HCT-8细胞TLRs的影响。方法 微小隐孢子虫IId亚型感染HCT-8细胞4 h及12 h后,提取细胞RNA,利用qRT-PCR方法检测TLRs的表达水平,并通过生物信息学分析表达差异显著的miRNAs与TLRs的关系。结果 HCT-8细胞表达TLR1-TLR10 10种TLRs,并且微小隐孢子虫IId亚型早期感染(4 h和12 h)导致TLR2和TLR4表达量较对照组上调有统计学意义,其它8种TLRs较对照组表达变化无统计学意义。生物信息学分析表明TLR2和TLR4 并不是表达差异显著的miRNAs靶基因,但这些表达差异显著的miRNAs可以靶向27个TLRs信号通路基因。结论 TLR2和TLR4在微小隐孢子虫IId亚型感染HCT-8细胞中可能发挥着一定的作用,差异表达miRNAs的预测靶向中有TLR信号通路相关基因。     

星形胶质细胞在阿尔茨海默病发病机制中的作用

星形胶质细胞是维持中枢神经系统内环境稳定、实现防御和再生功能的基石。星形胶质细胞功能缺失和反应性下降导致了大脑的生理老化和神经系统变性病的发生。星形胶质细胞在大脑老化以及阿尔茨海默病（AD）的病理生理机制中起重要作用,且参与人脑能量代谢。药物干预可以调节星形胶质细胞的形态和功能,这提示星形胶质细胞有可能被用来作为治疗AD的靶点。本文就星形胶质细胞在正常老化机制及AD发病机制中的作用进行综述。     

激活原代星形胶质细胞α7尼古丁胆碱能受体对PI3K/Akt/HSP70信号通路的影响

目的研究尼古丁激活星形胶质细胞α7尼古丁胆碱能受体(nAChR)对热休克蛋白(HSP)70表达的影响,探讨激活α7nAChR对阿尔茨海默病(AD)的神经保护作用及其机制。方法从刚出24 h内的小鼠的大脑皮质中分离出原代星形胶质细胞,培养并进行细胞纯度鉴定。将培养好的星形胶质细胞分为空白对照组、尼古丁组、α7nAChR阻断剂MLA组、MLA+尼古丁组、PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002组和LY294002+尼古丁组。用Western印迹法检测细胞内HSP70及P-Akt蛋白的表达情况。结果与对照组相比,尼古丁组中HSP70的表达水平显著升高(P0.01);与尼古丁组相比,MLA+尼古丁组中HSP70蛋白表达水平受到明显抑制(P0.05);LY294002+尼古丁组中HSP70蛋白表达水平明显受到抑制(P0.05);且尼古丁可以显著上调P-Akt蛋白水平(P0.05),该上调效应能被MLA或LY294002抑制(P0.05)。结论尼古丁激活星形胶质细胞α7nAChRs,可通过PI3K/Akt信号通路上调HSP70蛋白表达水平。     

脑缺血对阿尔茨海默病大鼠海马内病理特征及炎性反应的影响

目的观察脑缺血后阿尔茨海默病(AD)大鼠海马内的病理特征、炎性细胞及细胞因子表达的变化,探讨脑缺血在AD病程进展中的作用及机制。方法经Morris水迷宫筛选SD大鼠30只.随机分为AD组、AD+脑缺血组、对照组,每组10只。大鼠海马注射凝聚态淀粉β样蛋白_(1-10)成功建立AD模型后.海马注射内皮素-1建立脑缺血条件,观察脑缺血后AD大鼠海马内淀粉β样蛋白(Aβ)的沉积及神经元丢失的变化,采用免疫组织化学、原位杂交和RT-PCR检测脑缺血后AD大鼠海马内星形胶质细胞的数量和白细胞介素1β(IL-1β)、TNF-α表达的变化。结果与对照组比较,AD组和AD+脑缺血组大鼠海马星形胶质细胞数量、IL-1β和TNF-α表达均显著增多(P<0.01)。结论脑缺血促进了AD大鼠海马内Aβ的沉积和神经元的丢失,提示脑缺血可促进AD的病程进展,星形胶质细胞、IL-1β和TNF-α参与了这一过程。     

白藜芦醇对血红素氧化酶-1诱导的离体星形胶质细胞损伤的保护作用

目的探讨白藜芦醇对血红素氧化酶(HO)-1诱导的离体星形胶质细胞损伤的保护作用。方法体外培养、纯化获得星形胶质细胞,并构建HO-1基因转染入星形胶质细胞,在施加白藜芦醇干预后,运用CCK-8法检测细胞损伤情况,Western印迹检测HO-1蛋白的表达及普鲁士蓝染色法检测铁离子的沉积情况。结果 GFAP鉴定显示95%以上的细胞为星形胶质细胞;转染HO-1基因入星形胶质细胞后HO-1蛋白显著升高2.3倍;在施加白藜芦醇干预后,100μmol/L白藜芦醇均能降低HO-1蛋白的表达;同时,10、50μmol/L白藜芦醇也能够降低55%铁离子的沉积。结论白藜芦醇对HO-1诱导的离体星形胶质细胞损伤具有较好的保护作用。     

机械分离与胰酶消化分离对长期培养的神经干细胞神经发生能力的影响

目的 探讨神经干细胞(NSCs)培养的分离传代技术及其在长期培养条件下的神经发生能力.方法取孕14d的Wistar胎鼠大脑皮层,消化分离后,以1×105/ml浓度进行NSCs原代培养.分别采用机械分离与胰酶消化法进行NSCs传代培养,台盼蓝活细胞计数测定分离后细胞存活率,计算细胞倍增时间和细胞增殖率.取第4、8、12、20、30代机械分离传代培养的NSCs球接种到24孔培养板中的盖玻片上,加入分化培养液,观察长期培养条件下NSCs的神经发生能力的变化.结果与胰酶消化法进行的NSCs球传代相比,机械分离的NSCs球为小细胞球和单细胞传代,传代后细胞存活率高,细胞倍增时间短,增殖能力强(P均<0.05).体外长期培养条件下,随着培养时间的延长,NSCs分化为神经元的比例逐渐降低,星形胶质细胞的比例逐渐增高;在4～12代NSCs分化为神经元的能力表现出下降的趋势,但仍较为稳定;12代后,神经元的分化比例迅速下降,星形胶质细胞的比例迅速上升.结论与胰酶消化法相比,逐步减小吸管口径的机械分离传代法,减少了传代对细胞的损伤,保证了大部分细胞间连接的完整性,显著增强了NSCs的增殖能力.体外长期扩增的NSCs,由于微环境和(或)自身基因的调控.随着传代的延续,其神经发生能力逐渐降低,分化为神经元的比例逐渐减少,分化为星形胶质细胞的比例逐渐增加.     

U0126及地塞米松对氨培养SD乳鼠脑星形胶质细胞AQP4表达的影响

目的观察氨培养的脑星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达,地塞米松及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路抑制剂U0126对其表达的影响。方法分离、培养SD大鼠脑星形胶质细胞,分为氨培养组、氨培养+U0126组、氨培养+地塞米松组和正常对照组,采用免疫组织化学及逆转录聚合酶链式反应检测AQP4在蛋白和基因水平的表达和变化。结果氨可致培养的星形胶质细胞AQP4蛋白和AQP4 mRNA的表达增加。U0126和地塞米松均可使氨培养星形胶质细胞AQP4 mRNA和AQP4蛋白的表达减少。结论氨可致AQP4表达增加,U0126和地塞米松有细胞保护作用,可有效保护脑星形胶质细胞。     

慢性重型肝炎患者外周血单个核细胞中TLR2、TLR3和TLR9的mRNA表达

目的观察慢性重型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）TLR2、TLR3和TLR9的mRNA表达,为慢性重型肝炎发病机制的研究提供思路。方法用密度梯度离心法分离慢性重型肝炎患者PBMC后,提取总RNA,并逆转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测TLR2、TLR3和TLR9表达,并以肝硬化患者作为对照。结果慢性重型肝炎患者PBMC中TLR2和TLR9的mRNA表达较肝硬化患者明显增高,慢性重型肝炎患者TLR2和TLR9表达分别为肝硬化患者的2.73和2.52倍,而慢性重型肝炎患者TLR3的mRNA表达较肝硬化患者减少,慢性重型肝炎患者TLR3表达为肝硬化患者的88%。结论 TLR2、TLR9上调和TLR3下调可能参与了慢性重型肝炎的发病过程;动态观察患者体内TLRs表达可能更有助于揭示TLRs在慢性重型肝炎发病机制中的作用。     

大鼠局灶脑缺血/再灌注星形胶质细胞的反应和NF-κBp65、ICAM-1在星形胶质细胞中的表达

目的 探讨星形胶质细胞在局灶脑缺血/再灌注后炎症反应中的作用。方法 健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组、假手术组、模型组、PDTC干预组、生理盐水组,采用大脑中动脉线栓法制备局灶脑缺血/再灌注模型,结合HE染色、原位杂交、免疫组化、荧光免疫组化双标,观察缺血侧星形胶质细胞的变化以及NF-κB p65、ICAM-1在星形胶质细胞的表达。结果 局灶脑缺血/再灌注24h脑梗死面积最大,PDTC干预组脑梗死面积明显减少；模型组GFAP和2种炎性介质的表达都强于其它组(p<0.05),PDTC干预组GFAP和2种炎性介质的表达均低于模型组(p<0.05)。结论 局灶脑缺血/再灌注后早期大量反应性星形胶质细胞出现在缺血区并表达NF-κB p65、ICAM-1,可能启动炎症级联反应,影响其它神经细胞的继发反应。