23S rRNA基因在临床常见致病菌检测中的应用

目的 根据临床常见致病菌23S rRNA基因序列的差异，建立可初步鉴别革兰阴性菌和革兰阳性菌的分子生物学方法。方法 分析常见细菌的23S rRNA基因序列，设计相应引物。采用多重PCR扩增标准菌株及临床分离株23S rRNA基因，并根据电泳结果作出初步分类。结果 革兰阴性菌株均出现1条DNA电泳条带(约为350bp)，而革兰阳性菌株则出现2条电泳条带(约为250和400bp)。60株临床分离菌经PCR扩增、电泳后，电泳分析结果与常规鉴定结果符合率达100％。结论 23S rRNA基因检测用于细菌初步分类鉴定，具有快速、灵敏、准确的特点，可为细菌感染的实验室诊断提供客观依据。     

人苍白杆菌深圳分离株16S rRNA基因部分核苷酸序列分析

目的对深圳市布吉人民医院分离鉴定的1株人苍白杆菌进行16S rRNA基因的部分核苷酸序列分析,以探讨该菌株在分类学上的准确地位。方法对该菌株进行PCR扩增及16SrRNA基因序列测定,并与人苍白杆菌标准株及羊种布氏杆菌比较。结果3株细菌均可扩增到大小约900bp的16S rRNA基因片段,经核苷酸序列分析比较,发现人苍白杆菌深圳分离株与人苍白杆菌标准株和羊种布氏杆菌具有高度同源性,同源程度大于98%。结论该院分离的人苍白杆菌不仅与购自美国的人苍白杆菌ATCC株有高度同源性,而且与北京保存的羊种布氏菌在遗传学上也具有非常密切的亲缘关系。     

16SrRNA甲基化酶基因在产ESBLs肠杆菌科细菌中的分布

目的了解临床分离的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的革兰阴性肠杆菌科细菌中16SrRNA甲基化酶基因的分布情况。方法对临床分离的70株革兰阴性肠杆菌科细菌用VITEK．32型全自动微生物分析系统进行细菌鉴定,用纸片扩散法检测ESBLs,并用聚合酶链反应（PCR）检测armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA6种16SrRNA甲基化酶基因,对检测的阳性产物进行测序,并通过GenBank比对DNA序列。结果70株产ESBLs革兰阴性肠杆菌中,9株16SrRNA甲基化酶基因阳性,其中5株检出armA基因,4株检出rmtB基因,2株同时检出armA和rmtB基因,rmtA、rmtC、rmtD、npmA4种基因扩增均为阴性。结论不同地区医院16SrRNA甲基化酶基因的分布情况各不相同。     

分子水平快速诊断败血症致病菌的研究

目的通过合成所有细菌共有的16SrRNA基因高度保守区引物,进行PCR扩增,对8种标准菌株、10种40株临床分离细菌进行了研究,探索快速而准确诊断败血症的新方法,以达到早期治疗的目的。方法通过PCR技术,对40例败血症患者进行了分析,完成了对败血症患者的早期诊断。结果8种标准菌株、10种40株临床分离细菌均获得308bp扩增产物。结论PCR检测方法是一种易于推广的败血症早期诊断方法。     

肺炎克雷伯菌多重耐药性与基因PBP2、PBP3的相关性研究

目的探讨PBP2、PBP3基因在肺炎克雷伯菌对不同药物耐药中的作用与机制。方法收集该院2014年4月至2015年4月各科室临床标本中分离的非重复肺炎克雷伯菌203株,采用全自动微生物分析系统对菌株进行鉴定及药敏检测,提取细菌基因组DNA,用PCR扩增PBP2、PBP3产物并进行电泳,RT-PCR检测PBP2、PBP3的表达。结果 203株肺炎克雷伯菌中β-内酰胺类药物耐药105株(51.7%),敏感88株,对亚胺培南、美罗培南耐药率分别为5.4%、3.9%;PCR扩增产物的电泳条带中PBP2与PBP3基因阴性18株,阳性185株,但不平行,分别有各自的阴、阳性菌株;PBP2、PBP3与KP多重耐药性无显著相关(P=0.295、0.628)。PBP2与碳青烯酶类药物无显著相关(P=0.637);PBP3与碳青烯酶类药物存在显著相关,但相关系数不高(P=0.041,r=0.148);耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的PBP2、PBP3逆转录后扩增产物电泳条带与16SrRNA扩增产物电泳条带的灰度比值进行统计学检验,其差异均无统计学意义(PBP2:P=0.331,PBP3:P=0.383)。结论基因PBP2、PBP3与肺炎克雷伯菌多重耐药性之间可能无显著相关。     

自动细菌鉴定仪对布鲁菌误鉴定原因及临床影响分析

目的探讨Vitek Compact微生物自动鉴定仪器对1例布鲁菌误鉴定原因及临床影响分析。方法 1例无明显诱因发热患者血培养分离菌株,采用Vitek Compact细菌鉴定系统,形态学、传统手工生化对分离株进行鉴定。采用PCR扩增16S rRNA基因并测序,对所测得的核酸序列进行同源性比对分析。结果从该患者血液中分离到1株缓慢生长的革兰阴性短小杆菌,Vitek Compact鉴定仪器,GN鉴定卡首次鉴定为支气管炎鲍特菌,基于16S rRNA基因序列分析表明,菌株与马耳他布鲁菌或人苍白杆菌核酸匹配度高达100%,完全排除支气管炎鲍特菌的可能。将保存的菌株用Vitek Compact鉴定仪器,GN鉴定卡复检,结果为马耳他布鲁菌。结论 16S rRNA基因序列分析是鉴定临床非发酵革兰阴性杆菌的最有效手段,微生物自动鉴定仪器鉴定慢生长细菌如布鲁菌等有明显局限性,对布鲁菌病等传染病的临床治疗及流行病学调查可产生误导。     

肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药性及耐药机制研究

目的 了解肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)对大环内酯类抗生素的耐药情况及耐药机制.方法 对370份咽拭子标本进行MP分离培养,应用套式PCR扩增MP种特异16S核蛋白体RNA(16SrRNA)基因对临床分离株进行分子鉴定;通过药物敏感实验测定MP分离株对大环内酯类药物的MIC并筛选出耐药株;设计套式PCR扩增红霉素作用靶位23S核蛋白体RNA(23SrRNA)基因,扩增产物进行全自动DNA测序,测得序列与NCBI已登录的MP标准株M129(登录号X68422)23SrRNA基因作比对.结果 370份临床标本中分离MP 50株,分离阳性率为13.5%.50株中敏感株4株,耐药株46株(占92%).耐药菌株的红霉素、阿奇霉素、交沙霉素MIC值均升高.4株敏感株和肺炎支原体国际标准株FH的23SrRNA基因序列与基因库的MP基因序列相同,46株耐药株的23SrRNA基因发生点突变,41株突变位点在23SrRNA V区中心环的2063位,其中40株发生了A→G的点突变,1株发生了A→C的点突变;另5株突变位点在2064位,A→G.结论 MP对大环内酯类抗生素耐药率高,耐药性的分子基础是23SrRNA基因的点突变,其中2063位点突变占主导地位.23SrRNA基因发生点突变的肺炎支原体对红霉素、阿奇霉素及交沙霉素的MIC值均升高.     

两株鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定

目的应用基因测序方法对2株疑似非结核分枝杆菌的菌株进行初步菌种鉴定,指导临床用药治疗.方法将2株临床分离菌株1520、4108分别接种于罗氏培养基,观察其菌落生长状况;取生长对数期菌落,抽提菌株DNA;PCR扩增16S rDNA基因序列,对其PCR产物进行测序和NCBI网站Blast同源性比对,以进行菌株的初步鉴定.结果编号为1520、4108两株菌株,在罗氏培养基上生长迅速,均可见淡黄色粗颗粒样小菌落,疑似非结核分枝杆菌;以PCR扩增两株菌的16S rDNA基因序列,结果与鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)同源性极高,比例均达到99%.结论从肺科急诊患者体内分离到的菌株1520、4108为鼻疽诺卡菌,而不是非结核分枝杆菌,为临床在治疗方案上提供了有力的证据.同时, DNA测序分析能够快速、简便、准确地鉴定到菌种,为实验室疑难菌型鉴定提供了技术保障.     

1例引起突发性耳聋的猪链球菌的鉴定及分子流行病学分析

目的分离鉴定1例突发性耳聋患者血液和脑脊液分离的猪链球菌并进行分子流行病学分析。方法采用VITEK-2Compact微生物系统进行初步鉴定和药敏试验,PCR扩增细菌的16SrRNA基因、7个管家基因及4种毒力基因。通过实时荧光定量PCR进行血清学分型,多位点序列分型(MLST)进行序列分型(STs)。结果传统细菌鉴定方法和16SrRNA基因测定方法均鉴定为猪链球菌,实时荧光定量PCR鉴定为猪链球菌2型,MLST分型为ST7,毒力因子溶血素基因、细胞外蛋白因子编码基因、荚膜多糖编码基因均为阳性。结论引起患者突发性耳聋的细菌为我国常见的猪链球菌2型,属于ST7型强毒株。     

注射狂犬疫苗饮酒引起过敏反应一例报告

本文建立了一个用于检测军团菌的多聚酶链反应方法。扩增参考菌株的染色体DNA(L.pneumophital-14、L.micdadei、L.dumoffii Llongbeachae、L.Jordanis、L.bozemanii)，均可检出375bp的16SrRNA基因片段。对于已经监定的5株国内分离菌株染色体DNA进行扩增，获得了相同的结果，地高辛标记16SrRNA基因探针与扩增产物杂交，结果为阳性。而扩增14株非军团菌均为阴性。采用煮沸法制备细菌染色体DNA,PCR法检测环境水军团菌敏感性为280cfu/ml水，检查临床标本军团菌为560cfu/ml支气管灌洗液。上述结果表明该法敏感、快速、简便，具有较好的特异性。     

多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌

目的应用一种敏感快速的多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）,检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）和凝固酶阴性葡萄球菌（ＭＲＣＮＳ）。方法临床分离的北京地区金黄色葡萄球菌１２３株,ＭＲＣＮＳ１２２株,用溶壁素和蛋白酶Ｋ制备模板ＤＮＡ,设计葡萄球菌甲氧西林耐药的决定基因,金黄色葡萄球菌独有的一个辅助基因和细菌中均有的１６ＳｒＲＮＡ基因引物,通过多重ＰＣＲ技术对标本进行扩增。结果１２３株金黄色葡萄球菌的ｆｅｍＡ基因１００％（１２３／１２３）阳性,ｍｅｃＡ基因阳性的占１８．７％（２３／１２３）,１２２株ＭＲＣＮＳ的ｆｅｍＡ１００％（１２２／１２２）阴性,ｍｅｃＡ阳性的占２４．６％（３０／１２２）。１６ＳｒＲＮＡ基因片断在多重ＰＣＲ中作为内部参照避免了假阴性结果的出现。结论建立的多重ＰＣＲ技术检测ＭＲＳＡ和ＭＲＣＮＳ具有敏感、快速、特异的特点,是一种可靠的实验诊断手段。     

PCR扩增16S rRNA基因检测幽门螺杆菌的特异性研究

为了评估 PCR扩增 1 6S r RNA基因检测幽门螺杆菌的特异性 ,对 Hp和非 Hp临床分离菌株、胃活检组织、胃黏液、大便、淋巴细胞及其它非胃组织进行了 Hp的检测。 49株 Hp均出现 1 0 9bp特异扩增条带 ,而 7株非 Hp菌株为阴性 ;77份胃活检组织中 ,细菌培养阳性 48份 ,PCR阳性 50份 ;550份吞线取样的胃黏液标本 PCR扩增 Hp阳性 2 61份 (47.5% ) ;2 0份淋巴细胞、2 0份大便、5份乳房组织、4份肌肉组织、7份肺组织、2份脾组织和 3份肝组织标本 ,PCR扩增均阴性。结果显示 ,PCR法扩增 1 6S r RNA基因有较高的特异性 ,可用于临床标本 Hp的检测。     

细菌性肺炎快速诊断基因芯片的初步构建

目的：根据细菌16 S rRNA基因特点设计常见病原菌的特异性探针,采用酶显色技术构建基因芯片,探讨其临床应用的可能性。方法选取肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及铜绿假单胞菌等8种细菌性肺炎常见的病原菌的标准菌株作为研究对象,并选择12份患者的痰液标本进行检测。在16 S rRNA基因保守区设计 PCR反应的通用引物及革兰阳性菌、革兰阴性菌的通用探针,利用可变区的差异设计合成特异性探针,构建基因芯片。利用细菌16S rRNA基因设计的PCR通用引物进行扩增,所有8种细菌均获得350 bp的扩增产物。以地高辛标记特异性探针,构建完成可用于8种常见病原菌检测的基因芯片,结果8种标准菌株基因芯片检测均取得了预期效果,对12份痰标本中常规培养阳性7份,其对应芯片检测结果均成阳性,5份常规培养阴性的标本中,芯片结果提示阳性的有3份,其中1份为嗜肺军团菌,2份为使用抗生素后的患者标本。结论设计合成的 PCR通用引物对扩增细菌的16 S rRNA基因具有较高的特异性及灵敏度。构建的基因芯片可用于常见细菌性肺炎病原菌的检测鉴定,且对抗生素使用后的临床标本及苛养菌有一定的诊断价值。本研究所获得基因芯片对于细菌性肺炎的检测具有简单、快速、特异性及敏感性高的特点。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立

目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)在常规临床微生物鉴定中的性能验证方法,指导临床实验室规范微生物鉴定程序。方法选取标准菌株、质控菌株和临床菌株共115株,包含革兰阳/阴性球菌30株、革兰阳/阴性杆菌31株、真菌30株,厌氧菌、苛养菌各12株,所有菌株均经Vitek Compact鉴定和/或细菌16S r DNA、真菌ITS DNA测序分析验证。任意选择3种MALDI-TOF MS微生物鉴定系统厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱,采用检测系统推荐方法进行菌株鉴定,进行准确度验证试验。精密度验证:选取标准菌株和临床菌株10株,1位操作者使用3个检测系统对10株菌株分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d; 3位操作者使用3个检测系统对10株菌株每d分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d,从而验证鉴定结果的重复性。结果厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱对标准/质控菌株(除外厌氧菌)的鉴定符合率为100%;对临床菌株的属水平鉴定符合率为100%;对革兰阴/阳性杆菌的种水平鉴定符合率分别为100%、100%、96.77%;对革兰阳性球菌的种水平鉴定符合率分别为96.67%、96.67%、100%;对真菌的种水平鉴定符合率均为90%一致;对苛养菌的种水平鉴定符合率均为100%;对厌氧菌鉴定符合率为91.67%种水平一致。精密度验证试验结果重复性100%。结论 3种MALDI-TOF MS系统在革兰阳/阴性球菌、革兰阳/阴性杆菌、真菌、苛养菌鉴定的准确度和精密度符合要求,验证通过。本文建立的微生物鉴定质谱仪性能验证方案可满足综合性医院临床微生物实验室常规鉴定基本要求。     

一种快速同步检测肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变的新方法

目的 建立基于CycleavePCR技术的肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变株快速检测方法.方法 收集102株分离自2005-2008年上海市交通大学附属儿童医院住院患儿的肺炎支原体及136份2009年11-12月上海市交通大学附属儿童医院呼吸道感染的住院患儿经鼻采集鼻咽部痰标本,根据肺炎支原体无突变敏感株与突变耐药株23S rRNA基因2063/2064位的碱基差异及上下游保守序列分别设计新型特异性探针(Cycling探针)及引物,建立肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变株检测方法,以含有被检测靶序列的重组质粒为阳性对照,以常见呼吸道病原菌DNA为阴性对照,评价其敏感度及特异度.采用自建方法检测所有标本,并与常规PCR及测序结果比较.结果 该方法可准确检出并鉴别大环内酯类敏感及耐药突变株阳性对照,102株临床分离株中83株对大环内酯类耐药,测序表明82株发生23S rRNA基因A2063G突变,1株A2064G突变,与CycleavePCR检测结果相符,136份痰标本检测结果也与常规PCR扩增及测序结果相符.所有阴性对照样品均未出现假阳性.与常规PCR及测序方法相比,CycleavePCR法的敏感度和特异度均达100%.该方法的检测下限为10拷贝/PCR反应,扩增检测可在1.5 h内完成.结论 建立了一种基于CycleavePCR技术的肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变株快速检测方法,可同步提供病原菌及其耐药性信息,为肺炎支原体感染诊断及临床合理选用抗菌药物提供参考.     

革兰阴性杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测及作用研究

目的分析上海中医药大学附属普陀医院临床分离的革兰阴性杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行情况及革兰阴性杆菌的氨基糖苷类耐药机制。方法收集临床分离的对阿米卡星和/或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌53株。采用聚合酶链反应（PCR）法检测16S rRNA甲基化酶基因：armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;PCR阳性产物测序分析。构建PET32-armA和PET32-rmtB的重组质粒并转化入宿主菌BL21中。纸片扩散法（K-B）检测临床分离16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株和重组菌对5种氨基糖苷类药物的敏感性。结果 53株耐药菌中5株鲍曼不动杆菌、2株肺炎克雷伯和1株阴沟肠杆菌检出armA基因,2株大肠埃希菌检出rmtB基因。获得PET32-armA和PET32-rmtB的重组BL21菌株。PET32-armA和PET32-rmtB的重组菌均获得氨基糖苷类抗菌药物耐药性。结论本院临床样本检测到16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB阳性菌株,armA基因存在于鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中;rmtB基因位于大肠埃希菌中。将armA和rmtB基因转入非耐药的宿主菌中可以诱导其对氨基糖苷类抗菌药物的耐药。     

Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes

Specific primer pairs were selected for the PCR amplification of 14 tetracycline resistant genes commonly found in Gram positive and Gram negative organisms. Combinations of primer pairs were used in multiplex PCR reactions to detect specific groups of tet genes as follows; Group I tet (B), tet (C), tet (D); Group II tet (A), tet (E), tet (G); Group III tet (K), tet (L), tet (M), tet (O), tet (S); Group IV tetA (P), tet (Q), tet (X). To test the multiplex PCR, Groups I and II were used on 25 clinical isolates of Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104. Group III primers were used to investigate 19 clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Multiplex PCR should result in significant savings in terms of labour and cost in analysis of a large number of strains when compared with using an individual PCR for targeting each gene. It may also be a useful method to differentiate the types of tetracycline resistance when used as an additional marker for the purpose of outbreak investigation and surveillance.     

小儿常见感染菌16S—23S rRNA基因区间的分子生物学研究

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）加限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析在细菌rDNA区间检测中的应用。方法：以16S－23S RNA基因区间为靶序列,设计引物,选择合适的内切酶,采用PCR法加RFLP法检测标准菌株及临床菌株的rDNA区间。结果：26株不同的标准菌株经PCR扩增后,分别出现一条带,两条带,三条带及多条带的不同DNA图谱,敏感性试验可检出2．5CFU的细菌,与人类基因组DNA,真菌及病毒无交叉反应,其中14种菌经一步PCR扩增即可区分,另12种菌除肺炎克雷伯氏菌与坚韧肠球菌经Hinf I或Alu I酶切后仍不能区分外,其余经其中一内切酶酶切后均能区分,32例血培养阳性标本均扩增出与相应标准菌株相一致的图谱。结论：16S－22S rRNA区间基因PCR．扩增加RFLP技术检测细菌rDNA区间,具有特异,敏感,快速,准确的特点,为细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

富西亚分枝杆菌从血液与静脉插管中的分离与鉴定

目的对从同一患者血液和静脉插管中分离的两株抗酸阳性细菌B0793、V1948进行菌种鉴定。方法广谱PCR扩增细菌的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)基因与核糖核酸(RNA)聚合酶β亚单位(rpoB)基因,测序其核苷酸序列并与相关菌种进行同源性比对及系统发育分析,以传统的表型实验对基因鉴定的结果进行验证,并参考CLSI M24-A的方法和解释标准进行分离株抗菌药物的药物敏感性试验。结果该2株细菌均为血平板上生长缓慢的革兰染色着色较淡的抗酸阳性杆菌,但2株细菌的菌落形态差别较大,B793在血平板培养4d形成直径1cm、米黄色、圆形、突起、不溶血、易乳化的光滑型菌落,V948则为直径约2cm、米黄色、豆腐渣样、边缘不规则的粗糙型菌落。16SrRNA基因和rpoB基因序列与富西亚分枝杆菌(mycobacterium phocaicum)的同源性均在99%以上,其半定量触酶、68℃触酶试验、5%NaCl耐受试验与脲酶试验阴性,亦符合富亚分枝杆菌的特征。结论该2株抗酸阳性细菌在分类学上属于富西亚分枝杆菌,其光滑型/粗糙型菌落变异为国际上首次发现。     

Genetic diversity of Flavobacterium columnare examined by restriction fragment length polymorphism and sequencing of the 16S ribosomal RNA gene and the 16S-23S rDNA spacer

Genetic variability among strains of Flavobacterium columnare, isolated in the United States, was characterized by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and phylogenetic analysis based on the sequence of the 16S rRNA gene. Twenty-seven isolates of F. columnare were differentiated into three genotypes. The isolates within the genotypes were further grouped based on RFLP of the 16S-23S rDNA spacer. The first genotype had five strains that were further divided into group A (4 strains) and B (1 strain) while the second genotype had 10 strains that were also further divided into group A (4 strains) and B (6 stains). The third genotype had 12 isolates with no differences in the RFLP patterns of the 16S-23S rDNA spacers. The 16S rRNA gene sequences representing the three identified genotypes were compared to the different published sequences by phylogenetic analysis and the results showed the American genotypes 1, 2 and 3 corresponding to genomovar 1, 2, and 3, respectively, reported by Triyanto and Wakabayashi [Triyanto, Wakabayashi H. Genotyping of strains of Flavobacterium columnare from diseased fishes. Fish Pathol 1999; 34: 65-71]. The study demonstrates a method for RFLP and sequencing of the 16S rRNA gene and the 16-23S rDNA spacer as a useful tool in epidemiological studies of F. columnare.