利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。     

应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位

目的从噬菌体12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。方法将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白(Ig)作为靶分子筛选噬菌体随机12肽库。经过5轮淘筛，随机挑取24个蓝色噬菌斑进行扩增，以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值。结果24个克隆中有12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别，其中有2个克隆(P5、P6)具有较好的特异性和敏感性，可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。结论应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位，为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据。     

应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位

目的　从噬菌体 12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。　方法　将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白 (Ig )作为靶分子筛选噬菌体随机 12肽库。经过 5轮淘筛 ,随机挑取 2 4个蓝色噬菌斑进行扩增 ,以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值。　结果　 2 4个克隆中有 12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别 ,其中有 2个克隆 (P5、P6)具有较好的特异性和敏感性 ,可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。　结论　应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位 ,为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据。     

用噬菌体展示随机7肽库筛选血型A抗原模拟肽

目的:通过血型A单克隆抗体从噬菌体展示随机7肽库中筛选血型A抗原的模拟多肽。方法:通过对噬菌体随机7肽库进行3轮亲和筛选,从第三轮筛选后获得的洗脱物中挑选多个噬菌体克隆,采用ELISA方法鉴定阳性克隆,测序并推导噬菌体展示短肽的氨基酸序列,化学合成短肽、红细胞凝集抑制试验鉴定短肽模拟A抗原的能力。结果:三轮筛选后特异性噬菌体被富集了200多倍,对ELISA鉴定信号较强的16个噬菌体克隆DNA测序并推导氨基酸序列的结果显示两个克隆展示相同的序列FSYLPSH。化学合成肽能抑制A型红细胞与抗A的凝集作用。结论:肽FSYLPSH具有模拟血型A抗原表位的作用,具有代替天然血型A抗原在临床中应用的潜能。     

两种方法筛选噬菌体肽库所获日本血吸虫抗原模拟表位的抗原性比较

目的比较两种不同方法筛选噬菌体肽库所获得的日本血吸虫抗原模拟表位的抗原性.方法以日本血吸虫病患者血清免疫球蛋白(Sj-Ig)作为靶分子, 分别以噬菌体12肽库(SjA)和经过蚯蚓免疫兔血清免疫球蛋白(L-Ig)筛选一轮后的噬菌体12肽库(SjB)为原肽库,进行3轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选.随机挑取SjA和SjB蓝色噬菌斑各24个, 扩增后用ELISA方法检测其抗原性.结果 24个SjA克隆中有6个可以与Sj-Ig特异结合, 其中A491 nm值较高的2个克隆具有较好的特异性和敏感性;24个SjB克隆中有10个可以与Sj-Ig特异结合, 其中A491 nm值较高的5个克隆具有较好的抗原性.比较SjA 和SjB两组间克隆的抗原性,结果显示SjB的目的克隆具有更好的特异性和敏感性.结论从SjA 和SjB中均筛选到了对日本血吸虫病具有较高潜在诊断价值的抗原模拟表位,提示以异源性抗体结合后的肽库作为原肽库来筛选寄生虫抗原模拟表位是可行的,同时也为从噬菌体肽库中筛选抗原模拟表位提供了一个新的实验方法.     

从噬菌体肽库中筛选弓形虫抗原模拟表位初探

以弓形虫感染兔血清免疫球蛋白（Ig）作为靶分子，免疫筛选噬菌体随机7肽库和12肽库。经3轮筛选，随机挑取70个噬菌体克隆用ELISA检测其特异性，共获得43个阳性克隆。对23个ELISA反应较强的克隆进行测序，根据序列分析选择有代表性的克隆A7作为模拟表位抗原进行ELISA检测。对47份弓形虫感染兔血清进行ELISA检测，结果32份为阳性，敏感性为68.1%；155份健康人血清中弓形虫抗体呈阳性者10份，特异性为93.5%。从噬菌体随机肽库中能筛选到弓形虫抗原模拟表位有诊断弓形虫病的潜在价值。     

从噬菌体十二肽库筛选旋毛虫抗原模拟表位

目的　从噬菌体肽库筛选旋毛虫抗原的模拟表位 ,为研究和开发新的旋毛虫病诊断抗原提供实验依据。方法　以纯化旋毛虫病患者血清免疫球蛋白(Ts IgG)对噬菌体十二肽库进行5轮筛选 ,随机挑选24个克隆 ,通过ELISA选取吸光值(A)较高的6个克隆 (T1～T6) ,并检测其敏感性和特异性。　结果　T1～T6敏感性与旋毛虫幼虫抗原(TsA)相同(阳性率为100%,P>0.05) ,特异性与TsA无明显差异 (阴性率为0～40%,P>0.05),其中T3,T6与并殖吸虫病患者血清无交叉反应 ,特异性高于TsA(P<0.05),T6与日本血吸虫病患者血清无交叉反应 ,特异性亦高于TsA(P<0.05)。　结论　利用噬菌体十二肽库筛选到旋毛虫抗原模拟表位     

用噬菌体肽库筛选SjC-TPI的模拟抗原表位

目的　筛选日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 (SjC TPI)分子的模拟抗原表位 ,研究其免疫学特性。方法　用纯化的抗重组SjC TPI抗体 (IgG)筛选 12肽库 ,获取SjC TPI的模拟抗原表位 ,并研究其抗原特性。结果　获得SjC TPI分子的两个模拟抗原表位M1和M2 ,Westernblotting分析结果表明由这两个模拟抗原表位免疫小鼠产生的免疫血清能识别SjC TPI分子和含此两抗原表位的噬菌体外壳蛋白。DNA测序结果显示这两个模拟抗原表位的氨基酸序列与SjC TPI无同源性。结论　本研究获得的模拟抗原表位M1及M2为SjC TPI的空间构型抗原的模拟表位 ,具有较好的抗原性     

应用噬菌体随机肽库研究细粒棘球蚴抗原模拟表位

用抗细粒棘球蚴B抗原(EgB)多克隆抗体筛选噬菌体随机7肽库。经过5轮筛选后,噬菌体回收率从第1轮的4.15×10-5增加到第5轮的4.30×10-2,说明阳性克隆得到富集。随机挑取60个蓝色噬菌斑进行扩增,对其核苷酸序列进行测定分析并与EgB进行同源性比较。采用ELISA法对阳性噬菌体与抗EgB多克隆抗体结合特性进行检测,共检测出45个与抗EgB多克隆抗体结合的克隆株(阳性率为75%),其递呈的七肽序列与EgB的同源性低。采用ELISA法检测所选多肽对棘球蚴病所致过敏性休克患者抗血清的反应性,结果显示,细粒棘球蚴病患者抗血清与45个阳性噬菌体克隆反应的吸光度(A410值)比其与7肽库反应的A410值大2倍以上,该45个阳性噬菌体克隆与EgB多克隆抗体的结合是特异的。提示成功分析细粒棘球蚴囊液B抗原肽表位以及模拟表位。     

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的　筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。　 方法　用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。　结果　经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。　结论　获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 ,3种为模拟表位     

噬菌体随机十肽库的构建

目的采用丝状噬菌体表达载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十肽库。方法人工合成编码随机十肽的寡核苷酸片段及两条分别有SfiI和Notl酶切位点的引物,通过PCR反应得到其双链片段,将其克隆入载体pHEN1中,将重组产物转化入大肠杆菌TG1,构建成随机肽库。结果所建肽库含 1×10~9个集落形成单位(cfu)。随机挑取8个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机。结论成功构建了有较高库容量的噬菌体随机十肽库。     

噬菌体展示技术筛选日本血吸虫抱雌沟蛋白分子受体

目的筛选日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用分子。方法利用噬菌体展示技术,以融合表达的抱雌沟蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法筛选日本血吸虫44d成虫噬菌体展示cDNA文库。结果得到70条有效表达序列标签,对其进行聚类分析、同源性搜索与功能预测等生物信息学分析,获得5个与血吸虫抱雌沟蛋白有相互作用的蛋白或多肽。结论采用筛选噬菌体展示文库的方法成功获得抱雌沟蛋白相互作用分子。     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的　通过大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞抗原对人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体原始库的反复筛选 ,鉴定抗体库的特性并检测其与人大肠癌相关抗原的结合活性。方法　PCR鉴定阳性重组菌xL1 B1ue中人大肠癌相关抗体Fab段的插入率 ,构建人大肠癌Fab段原始库 ,提取 3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原 ,13例非致敏大肠癌组织抗原及 3种体外培养的大肠癌细胞株Lovo、HT 2 9、LS 174T的抗原各自等体积混合 ,利用 3组混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选 ,将筛选后的三个三级库等体积混和后通过ELISA法鉴定其与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的结合活性 ,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果　N片段及κ链的插入率分别为 40 %和 70 % ,Fd片段及κ链均插入质粒Pcomb3的重组率为 2 8% ,Fab段基因库库容为 2 .1× 10 6,3组大肠癌混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选后 ,抗体库均得到了不同程度的富集 ,ELISA显示富集后的Fab段抗体库对大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性。结论　利用噬菌体抗体库技术筛选出了相关抗大肠癌Fab段抗体 ,且筛选后的抗体片段与人大肠癌相关抗原有较特异性的结合活性     

结肠癌患者淋巴结构建抗结肠癌噬菌体Fab抗体库

目的　构建 2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库。方法　取 2个结肠癌患者转移淋巴结 ,提取淋巴结总RNA ,逆转录PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物插入载体 pComb3的相应部位 ,噬菌体VCSM13辅助感染。以点印迹检测噬菌体表面Fab的表达。 结果　所选 2种Ig亚类的重链Fd片段、2种κ轻链cDNA得到扩增。Fd片段和κ轻链均插入 pComb3的重组率为 40 %,Fab噬菌体表达库容量达 1.48× 10 6。噬菌体悬液的点印迹免疫染色显示有Fab表达。结论　构建了 2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库 ,为筛选结肠癌相关抗体奠定了基础。     

斑点免疫金渗滤法快速检测沙门氏菌O_9抗原的研究

目的　利用针对沙门氏菌O9抗原单克隆抗体 3- 4 7- 0和胶体金标记亲和纯化的羊抗鼠IgG ,建立一种以微孔滤膜为固相载体 ,快速检测沙门氏菌O9抗原的斑点免疫金渗滤法 (DIGFA)。方法与结果　以沙门氏菌点膜 ,加入单抗 3- 4 7- 0 ,洗涤后再加入胶体金标记的羊抗鼠IgG ,阳性结果呈红色圆点 ,阴性结果无颜色 ,整个检测过程仅需 10min。肠炎沙门氏菌标准菌株测定该方法灵敏度为 6× 10 4CFU/点。该方法可检测所有已知含O9抗原的沙门氏菌 ,而不与其它沙门氏菌、肠杆菌科其他细菌和常见革兰氏阳性细菌反应。人工感染样品经前增菌和选择性增菌处理后即可进行瞬时检测。结论　建立了一种快速、简便、准确检测沙门氏菌O9抗原的斑点免疫金渗滤法 ,在人类医学和动物医学领域有着广阔的应用前景     

噬菌体表面展示技术筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白

目的:通过筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白,为隐源性肝炎的发病机制研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,将隐源性肝炎患者血清作为固相筛选蛋白,用噬菌体正常人肝细胞T7cDNA文库进行5轮生物筛选,经噬斑PCR,对筛选克隆进行DNA序列分析,将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列,然后再探讨该蛋白在隐源性肝炎发病机制中的作用.结果:噬菌体经过5轮生物富集后,从随机筛选的60个克隆中得到24个阳性克隆,经序列测定后进行同源搜索,初步确定人类HCVNS5A转化调节蛋白13(NS5ATP13)为人体肝脏中固有的与隐源性肝炎血清蛋白结合的蛋白.结论:应用T7cDNA噬菌体表面展示技术,我们发现隐源性肝炎血清蛋白与人类肝细胞HCVNS5A转化调节蛋白13相互作用,在隐源性肝炎发生及抗病毒治疗有重要意义.     

乙型肝炎病毒表面抗原人源单链可变区抗体基因的克隆与鉴定

目的 筛选,鉴定抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗ＨＢＶ的基因治疗研究奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯化铯超速离心法纯化的ＨＢｓＡｇ蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”淘洗过程,获得抗原结合活性较强的ＨＢｓＡｇ人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫     

Affinity peptide developed by phage display selection for targeting gastric cancer

AIM: To develop an affinity peptide that binds to gastric cancer used for the detection of early gastric cancer.METHODS: A peptide screen was performed by biopanning the PhD-12 phage display library, clearing non-specific binders against tumor-adjacent normal appearing gastric mucosa and obtaining selective binding against freshly harvested gastric cancer tissues. Tumor-targeted binding of selected peptides was confirmed by bound phage counts, enzyme-linked immunosorbent assay, competitive inhibition, fluorescence microscopy and semi-quantitative analysis on immunohistochemistry using different types of cancer tissues.RESULTS: Approximately 92.8% of the non-specific phage clones were subtracted from the original phage library after two rounds of biopanning against normal- appearing gastric mucosa. After the third round of positive screening, the peptide sequence AADNAKTKSFPV (AAD) appeared in 25% (12/48) of the analyzed phages. For the control peptide, these values were 6.8 ± 2.3, 5.1 ± 1.7, 3.5 ± 2.1, 4.6 ± 1.9 and 1.1 ± 0.5, respectively. The values for AAD peptide were statistically significant (P < 0.01) for gastric cancer as compared with other histological classifications and control peptide.CONCLUSION: A novel peptide is discovered to have a specific binding activity to gastric cancer, and can be used to distinguish neoplastic from normal gastric mucosa, demonstrating the potential for early cancer detection on endoscopy.     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的免疫组化鉴定

目的：鉴定基因工程抗体库技术构建的人源性大肠癌自然致敏噬菌体Fab段抗体库与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的特异性结合活性。方法：通过免疫组化的方法检测抗体库对人大肠癌标本及体外培养的大肠癌lovo细胞的结合活性，并取绒毛状腺瘤、胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果：30例大肠癌有22例发生了阳性反应；肠息肉、胃癌、食管癌、正常肠粘膜各取20例，发生阳性反应的分别为13例、5例、4例和1例，体外培养的胃癌、肝癌细胞未发生阳性反应。结论：大肠癌噬菌体抗体库能较特异性地与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞结合。