人骨形成蛋白-2对人脑胶质瘤细胞增殖细胞周期的影响及其抑瘤作用

本研究旨在观察人骨形成蛋白(ＢＭＰ) 2对人脑胶质瘤细胞增殖、细胞周期的影响及其抑瘤作用 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.材料 :人脑胶质瘤细胞系ＳＨＧ 44由本所保存。 18只ＢＡＬＢ/Ｃ胸腺缺陷裸小鼠 ,4～ 6周龄 ,体重 (18± 2 )ｇ ,购自本校动物实验中心。重组人骨形成蛋白 2 (ｒｈＢＭＰ 2 )由本校生物化学教研室蒲勤博士提供 ,16 40培养基及胰蛋白酶购自Ｇｉｂｃｏ公司。四甲基唑蓝 (ＭＴＴ)及二甲基亚砜 (ＤＭＳＯ)购自华美生物公司。2 .细胞培养 :参照司徒镇强[1] 方法。3.ＭＴＴ实验 :以 5× 10 3 个对数生长期细胞接种于…     

Claudin-7基因敲除模型的建立

为研究Claudin-7在机体中的功能[1],我们建成Claudin-7基因敲除小鼠模型并分析其特点. 一、材料与方法 1.材料:利用DNA同源重组技术建立基因敲除小鼠,SPF级动物房饲养,兔抗COX-2、P-Histone H3多抗(cell signaling,USA),兔抗Claudin-7多抗购自日本IBL公司;鼠抗GAPDH单抗购自美国Calbiochem公司;抗兔和抗鼠辣根过氧化酶标记的二抗购自美国Promega公司.     

p53联合伽玛刀治疗对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用

有研究表明，转染野生型p53基因可以提高恶性胶质瘤的放射治疗敏感性，p53联合伽玛刀（单次大剂量）治疗胶质瘤的研究报道尚少，本实验对此进行了研究。 一、材料和方法 1．材料：C6鼠脑胶质瘤细胞系（经证实无p53突变）；293包装细胞系；野生型p53重组腺病毒载体（Ad-053）及空载腺病毒（Ad-βgal）。[第一段]     

白细胞介素18对肝细胞肝癌治疗的实验研究

目的研究携带白介素 18基因的腺病毒载体包装细胞对体内肝癌生长抑制作用。方法　构建白介素 18腺病毒载体 ,并进一步通过与Ad5腺病毒DNA TPC复合物同源重组 ,制备IL 18的复制缺陷性重组腺病毒 ,并对实验性肝癌大鼠进行治疗 ,观察抗癌作用。结果IL 18的复制缺陷性重组腺病毒包装细胞肝内局部或脾内注射后抑制肝癌细胞系CBRH3 的生长 ,接种CBRH3 第 1,3天注射者长期生存 ,第 5 ,7天注射者生存期延长空白组及空载体对照组注射者均见癌灶生长 [P =0 0 0 15 ,生存时间 (2 1± 4 )d]。结论肝癌局部及脾内注射IL 18的复制缺陷性重组腺病毒包装细胞能产生有效的抗癌作用 ,早期治疗优于晚期治疗 ,脾内注射安全有效。     

白细胞介素-12基因再修饰基因瘤苗免疫小鼠的脾细胞过继治疗肝癌

目的　探讨白细胞介素 (IL) 2和B7 1双免疫基因转染肝癌细胞瘤苗免疫小鼠后获得的脾淋巴细胞经mIL 12基因修饰后治疗小鼠肝癌的可行性和疗效。方法　用 2 0 0PFU 细胞滴度的重组腺病毒载体 (Adv)将人IL 2和B7 1基因共同转染小鼠肝癌Hepal 6细胞株 ,经 80mg L丝裂霉素 (MMC)处理制备成肝癌细胞瘤苗 ,免疫同系小鼠后分离其脾淋巴细胞 (SLC) ,转染mIL 12基因 (Adv滴度 2 0 0PFU 细胞 )后注射入直径 1cm的小鼠皮下移植肝癌内 ,观察抗瘤效果。结果　转mIL 12基因SLC治疗组小鼠瘤体增加值最小 ( 0 .0 8± 0 .0 5 )cm3,与各对照组比差异有显著性 [(转染BGFP基因SLC、未转染SLC和生理盐水注射组分别为 ( 3 .46± 0 .15 ) ,( 3 .5 6± 0 .2 3)和( 8.12± 0 .5 4)cm3,P <0 .0 5 ]。结论　IL 2和B7 1双基因修饰肝癌瘤苗诱导小鼠产生的免疫脾淋巴细胞可能成为一种新的过继免疫治疗效应细胞及携带IL 12基因的载体细胞 ;基因治疗、特异性主动免疫和过继性细胞免疫治疗结合将有更优越的抗瘤效果。     

小鼠SCP2基因shRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠SCP2基因shRNA重组腺病毒载体,进一步研究SCP2基因与胆囊胆固醇结石形成机制.方法 (1)两步PCR法合成针对小鼠SCP2基因shRNA,并连接到质粒PDC312上;(2)采用AdMax TM Adenoviru5 Vector系统包装病毒,CsCl法纯化病毒、TCID50法测定滴度;(3)Western印迹检测SCP2蛋白验证重组腺病毒沉默效果,RT-PCR检测重组腺病毒在小鼠hepa-1～6细胞中SCP2、HMGCR、CYP7A1基因mRNA的表达.结果 (1)腺病毒载体Adsh1RNA和Adsh2RNA对SCP2均有抑制作用,在SCP2mRNA水平,与AdsshRNA组比较,Adsh1RNA tD1=9.056,P＜0.05,Adsh2RNA tD2=7.777,P＜0.05,差异均有统计学意义,蛋白水平与mRNA一致;(2)SCP2基因低表达时,CYP7A1 mRNA表达升高,t=10.68,P＜0.05,HMGCR mRNA表达下降,t=10.10,P＜0.05,差异有统计学意义.结论 成功构建小鼠SCP2基因的shRNA重组腺病毒载体.SCP2低表达时可能影响HMGCoA还原酶和CYP7-α1羟化酶的活性,导致胆固醇代谢的变化,从而减少胆固醇结石的形成.     

连接蛋白43联合自杀基因治疗胶质瘤的研究

我们在体内、外研究了连接蛋白(Connexin ,Cx) 43基因与自杀基因联合治疗胶质瘤 ,以期提高胶质瘤自杀基因治疗的疗效。一、材料与方法1.通过同源重组获得复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV tk)。Southern杂交鉴定。空斑法测定腺病毒滴度。2 .脂质体介导Cx43cDNA的转染见文献 [1]。3 .原位杂交 :采用地高辛标记的TK( 1.8kb)和Cx43( 1.39)探针[1] 。4.体外实验 :96孔板每孔接种 4×10 3C6Cx/C6细胞 ;按重复感染率 (MOI)= 0 ,10 (CG10 /G10 ) ,10 0 (CG10 0 /G10 0 ) ,加入AdCMV tk孵育 12h ;加入浓度为 0 ,10 -3 ～ 10 3 mg/L更昔洛韦…     

携带大鼠白细胞介素-10基因重组腺病毒载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的　构建载有白细胞介素 10 (IL 10 )基因的 ,能在肝星状细胞 (HSC)稳定表达的重组腺病毒载体 ,为将来的肝纤维化基因治疗提供基础。方法　将IL 10cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒PAdTrack CMV ,得到重组质粒PadTrack CMV IL 10。采用电穿孔法将质粒PadTrack CMV IL 10与腺病毒骨架质粒PadEasy 1共转化E .coliBJ5 183细胞 ,通过在细胞内同源重组 ,生成带有IL 10基因的重组腺病毒载体。重组腺病毒质粒经过 2 93细胞的扩增及CsCl的纯化 ,感染HSC细胞。结果　经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应 (PCR)和逆转录 (RT ) PCR等方法的鉴定 ,证实了载体构建的正确性 ,经测定 ,病毒滴度为 2 .5× 10 10 efu/ml。结论　成功构建带有IL 10cDNA的重组腺病毒载体 ,所携带的IL 10载体能够转染大鼠HSC并在HSC中稳定表达 ,为进一步的研究打下了基础。     

小鼠白细胞介素-2基因修饰肝癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用

我们利用阳离子脂质体Ｔｒａｎｓｆｅｃ ｔａｍ将携带小鼠白细胞介素 (ｍＩＬ) 2基因的真核表达质粒导入小鼠肝癌细胞 ,经放射线照射后制成瘤苗 ,观察其对荷瘤小鼠的治疗作用。一、材料和方法1.主要试剂 :阳离子脂质体Ｔｒａｎｓ ｆｅｃｔａｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ｍＩＬ 2采用酶联免疫吸附测定法 (ＥＬＩＳＡ法 )测定 ,检测试剂盒购自Ｅｎｄｏｇｉｎ公司。质粒携带ｍＩＬ 2基因的真核表达质粒(ＶＲ1110 ) [1] 由美国Ｖｉｃａｌ公司惠赠。2 .实验动物和细胞株 :雌性ＢＡＬＢ/Ｃ小鼠 ,6～ 8周龄 ,购自上海医科大学实验动物中心。小鼠肝…     

稳定整合靶向EGFL7基因的shRNA载体的胶质瘤细胞系的建立

目的构建针对EGFL7基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人胶质瘤细胞系。方法根据EGFL7基因的编码序列设计并合成针对EGFL7基因的特异性shRNA,将其克隆入pSilencer3.1-H1neo载体中,重组载体经脂质体LipofectamineTM2000介导转染胶质瘤细胞株U251;转染细胞经G418筛选,采用Westernblot方法在蛋白水平检测筛选出的G418抗性的克隆细胞。结果酶切鉴定和测序证实,成功构建了靶向EGFL7基因的shRNA真核表达载体pSilencer-shEGFL7,并获得了稳定表达靶向EGFL7基因的shRNA的胶质瘤细胞株。结论 EGFL7基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制EGFL7基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究EGFL7在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了基础。     

p16基因转染肾癌细胞体外生物学特性的研究

将抑癌基因 ｐ1 6通过腺病毒载体导入小鼠肾癌Ｒｅｎｃａ细胞株中 ,观察 ｐ1 6基因导入后肿瘤细胞的生物学行为 ,并采用ＥＬＩＳＡ法检测Ｒｅｎｃａ细胞中 ｐ1 6蛋白的动态分泌水平 ,为抑癌基因疗法提供实验依据。材料和方法　小鼠 ｐ1 6及ＬａｃＺ重组腺病毒载体ＡｄＰ1 6和ＡｄＬａｃＺ由日本癌症研究会分子生物学治疗研究室Ｈａｍａｄａ博士惠赠。小鼠Ｒｅｎｃａ肾癌细胞株由美国国立癌症研究室Ｗｉｌｔｒｏｕｔ博士惠赠。人胚肾细胞株 2 93细胞为缺陷型腺病毒载体包装细胞 ,重组腺病毒的滴度测定采用微量细胞病变法[1 ] 。转染方法 :将…     

B7-1、B7-2联合应用治疗小鼠肝癌的研究

我们应用含小鼠B7—1、B7—2基因片段的真核表达载体PCI—neo-B7—1和PCI—neo-B7—2分别转染H22肝癌细胞。探讨B7—1、B7—2在肿瘤免疫过程中的不同功能与作用。     

抑瘤细胞运动和侵袭的鼠FRNK重组腺病毒的构建

目的应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建小鼠FRNK基因重组腺病毒，并在293HEK细胞中扩增制备重组病毒。方法把小鼠FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中，构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV-FRNK，经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后，采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中，通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到293HEK细胞进行包装，获得FRNK重组腺病毒pAdFRNK。荧光显微镜下观察绿荧光的表达。结果经酶切和绿荧光表达证明了小鼠FRNK基因的重组腺病毒载体pAdFRNK构建成功，并制备出高滴度的重组病毒。结论成功构建携带小鼠FRNK基因的重组腺病毒pAdFRNK，为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

重组腺病毒介导IL-12、IL-2联合基因治疗前列腺癌的实验研究

目的　探讨转移性前列腺癌的治疗方法 ,为前列腺癌免疫基因治疗提供实验依据。　方法　采用重组腺病毒介导IL 12、IL 2联合免疫基因疗法 ,对 6 6只C5 7BL/ 6小鼠前列腺癌模型进行致瘤性和抑瘤性观察。　结果　腺病毒AdmIL 12、AdhIL 2能有效表达目的基因。接种野生型 ,转AdLacZ及转AdmIL 12、AdhIL 2混合RM 1细胞的小鼠致瘤比例分别为 10 / 10、10 / 10及 2 / 10 ;成瘤时间分别为 (12 .3± 1.5 )d、(12 .8± 1.0 )d、(2 2 .5± 2 .1)d ;接种 30d后肿瘤结节直径分别为 (35 .0±2 .0 )mm、(34 .0± 2 .6 )mm、(10 .5± 3.5 )mm。与对照组相比 ,转AdmIL 12、AdhIL 2基因RM 1细胞小鼠致瘤率下降 ,成瘤时间延迟 (P <0 .0 1)、瘤结节小 (P <0 .0 1)。AdmIL 12、AdhIL 2瘤体注射还可抑制肿瘤生长 (P <0 .0 1) ,减少肺转移灶数目 (P <0 .0 1)。　结论　IL 12、IL 2联合基因治疗可诱发前列腺癌小鼠的肿瘤特异性免疫反应。     

固醇携带蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体,研究其与胆固醇结石形成的关系。方法:(1)利用RT-PCR技术克隆小鼠SCP2基因,在其上游接入白蛋白(ALB)启动子,下游连接绿色荧光报告基因(EGFP),构建穿梭质粒pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP;(2)采用Ad Max TM Adenoviru5 Vector系统包装病毒,CsCl法纯化病毒、TCID50法测定滴度;(3)重组腺病毒感染小鼠hepa-1-6细胞,实时定量PCR检测mRNA的表达;Western印迹检测SCP2蛋白表达情况;结果:成功构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体;当SCP2基因过表达时,CYP7a1基因表达下调,(t=3.97,P<0.05)HMGCR基因基因表达上调,(t=3.23,P<0.05)。结论:当SCP2基因过表达时引起HMGCR、CYP7a1基因转录水平的变化,提示SCP2基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。     

B7.1和B7.2基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的 构建含鼠源性B7．1和B7．2真核表达载体体系，研究其在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达的方法。方法 将目的基因全长cDNA分别亚克隆到真核表达载体PCI-neo中，获得B7．1和B7．2正向单拷贝插入重组子PCI-neo-B7．1和PCI-neo-B7．2，采用酶切法和测序法鉴定。采用阳离子脂质体将PCI-neo-B7．1／B7．2分别转染CBRH7919，经G418筛选，获得阳性克隆，命名为PCI-neo-B7．1／B7．2-CBRH7919 细胞。逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因在CBRH7919中的表达。结果 PCI-neo-B7．1／B7．2酶切后，电泳显示918bp和942bp的目的基因片段和5．4kbp的线性化PCI-neo载体片段；重组子测序结果与Genebank中B7．1和B7．2序列相符，证实构建成功。RT-PCR检测结果显示B7．1和B7．2均在PCI—neo—B7．1／B7．2—CBRH7919 中获得稳定表达。结论 重组真核表达载体构建正确，并在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达，为其在肝癌分子免疫治疗研究中应用奠定基础。     

白细胞介素-12、γ干扰素协同共刺激分子B7-1诱导淋巴细胞活化的研究

为了探讨肿瘤免疫反应中细胞因子对B7 1肿瘤细胞诱导淋巴细胞活化有无协同作用 ,我们观察了γ干扰素、白细胞介素 12对转B7 1基因肝癌细胞表面的B7 1分子表达的影响。一、材料和方法1.材料 :HepG2细胞株 ,HepG2 /B7 1细胞株由苏州大学附属第一医院血研所赠送。鼠抗人直标B7 1单抗、CD4单抗、CD8单抗、CD2 5单抗购自深圳晶美生物有限公司。IFN γ ,IL 2ELISA试剂药盒购自上海森雄生物有限公司。2 .细胞株的培养 :将用液氮冷冻的HepG2细胞和HepG2 /B7 1细胞快速复温解冻 ,种植于细胞培养液中 ,于 3 7℃ ,5 %CO2 的条件下培养 ;…     

体内腺病毒介导基因转移抗凋亡Bcl-2基因以减轻肝缺血-再灌注损害

作者在雄性C57BL／6鼠实验观察Bcl－2暂时性过度表达以防止肝缺血一再灌注（I／R）的作用。先制成重组腺病毒载体。实验动物在麻醉下剖腹，在肝中叶的根部用微血管锥夹住30～40分钟，肠系膜上动脉夹住20～30分钟，共减少肝血流70％。放松血管夹后开始再灌注。转移腺病毒介导基因至肝脏，在1／R损害前48小时分别自尾静脉内注入1×109pfuAdcmVLacZ或Ad－cmVhffel－2。动物分成3组：第1组（8只鼠）注射磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照，第2组和第3组（各8只鼠）各注入统有AdcmVLacZ和AdcmVhBcl－2的重组腺病毒载体。自肝冰冻活极组织测B…     

重组腺病毒相关病毒作为肝癌基因治疗载体的初步研究

目的 探讨重组腺病毒相关病毒（rAAV）的制备以及作为肝癌基因治疗载体的可行性。方法 重组报告基因加强的绿色荧光蛋白（EGFP）基因至质粒载体pSub201,用双质粒共转染方法制备重组腺病毒相关病毒颗粒（rAAV/EGFP),观察其对肝癌细胞系的感染性。结果 用常规的双质粒共转染方法制备高产量的rAAV(10^7-10^8感染单位／10cm板）;当病毒感染多重性（MOI）＝100时,rAAV/EGFP对肝癌细胞HepG2的转染效率可达100％。结论 重组腺病毒相关病毒可有效地转导外源基因至肝癌细胞,其作为肝癌的基因治疗载体具有较好的研究前景。     

腺病毒载体介导反义Src基因治疗胶质瘤

目的 探讨腺病毒载体介导的反义Src基因对胶质瘤生长的作用及其机制.方法 应用携带反义Src基因的重组腺病毒体外感染C6胶质瘤细胞,观察其对细胞形态、生长曲线和克隆形成率的影响.建立大鼠胶质瘤动物模型,原位注射重组腺病毒.观察其治疗作用,Western blot检测肿瘤组织Src、Ras、MAPK蛋白的表达,实时逆转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测肿瘤组织Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达.结果 体外研究表明感染反义Src基因的C6胶质瘤细胞生长受到显著抑制.体内研究表明应用携带反义Src基因的腺病毒原位注射治疗大鼠胶质瘤能够抑制肿瘤生长,减少Src、Ras、MAPK蛋白的表达,增加Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达.结论 腺病毒载体介导的反义Src基因能够抑制大鼠胶质瘤细胞的生长.Src-Ras-MAPK信号通路参与胶质瘤的生长,抑制该信号通路可以增加凋亡通路关键蛋白Caspase-3、Caspase-8的表达.