CD自杀基因联合淋巴细胞趋化因子基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理研究

本研究以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因与小鼠淋巴细胞趋化因子(Ltn)基因体内联合转染,观察了其抗肿瘤效应并分析了免疫机理.小鼠皮下接种结肠腺癌CT26细胞后3天,肿瘤局部注射表达Ltn的重组腺病毒AdLtn和表达CD的重组腺病毒AdCD,然后连续10天给予5一氟胞嘧啶(5-FC)300mg/kg进行治疗,结果表明,联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长受到明显抑制,小鼠存活期明显长于单用AdLtn治疗组或单用AdCD/5-FC治疗组.经联合治疗后小鼠脾细胞的NK活性和对(37结肠腺癌细胞的CTL杀伤活性明显增强.瘤体细胞FACS分析结果表明,经联合基因治疗后,肿瘤组织CD4~ 、CD8~ 细胞浸润增加,结肠腺癌细胞表达H-2Kd和B7-1分子明显增加.提示经CD自杀基因和Ltn基因联合治疗后,肿瘤细胞免疫原性增加.本研究结果表明联合应用自杀基因和Ltn基因治疗可以提高机体对肿瘤细胞免疫的应答,增加机体的抗肿瘤作用,是肿瘤基因治疗中一条新的途径.     

GM-CSF和多种细胞因子基因转导系统及其抗肿瘤免疫效应的研究

为了增强免疫基因治疗瘤菌诱导机体抗肿瘤系统免疫效应,我们应用逆病毒中介基因转移技术,将IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IFN-α、B7-1、TNF-α、GM-CSF等多种细胞因子基因导入肿瘤细胞,证实了这些基因修饰的肿瘤细胞.由于多种细胞因子基因的导入,诱导宿主抗肿瘤系统免疫能力明显增强.在此基础上,我们为了开发增强宿主免疫的肿瘤基因治疗新方案,构建了可以表达双价细胞因子GM-CSF、TNF-α、IL-4的逆病毒载体的基因修饰瘤苗.通过接种放射线灭活的分泌GM-CSF和IL-4细胞因子的肿瘤细胞即细胞因子肿瘤疫苗,来诱导有效地抗肿瘤系统免疫功能.应用构建的双价逆病毒载体和逆病毒中介基因转移技术,对肺癌、脑肿瘤小鼠模型进行了双价细胞因子基因瘤苗的抗肿瘤免疫增强效果和     

T细胞及相关免疫分子在淋巴细胞趋化因子增强肿瘤自杀基因疗法中的作用

本室以往的研究表明,用腺病毒作为载体将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因与小鼠淋巴细胞趋化因子(Itn)基因联合体内转染,具有显著的抗肿瘤效应.本文对其免疫机理进行了进一步研究,发现CT26结肠腺癌细胞体外经过CD/Ltn基因转染并给予前体药物5-FC后,CT26结肠腺癌细胞表达CD80和CD54分子明显增加,提示经CD自杀基因和Ltn基因联转移后,肿瘤细胞免疫原性增加.荷瘤小鼠体内经联合治疗后,小鼠脾细胞分泌IL-2和IFN-γ明显增加.体内用抗CD4、CD8抗体阻断实验研究结果的表明,联合应用自杀基因和Ltn基因治疗主要通过诱导CD8~ T细胞发挥抗肿瘤作用.     

表达RANTES基因的腺病毒载体构建及抗肿瘤作用研究

目的:构建表达活化T细胞表达和分泌的调节因子(regulatedonactivationnormalTexpressedandsecreted,RANTES)基因的腺病毒载体并研究其抗肿瘤作用机制和效果。方法:RT-PCR法克隆人和鼠源性(regulatedonacti-vationnormalTexpressedandsecreted,RAN-TES)基因,采用AD-easyXLAdenovirusVectorSystem试剂盒分别构建表达上述基因的腺病毒载体。通过趋化试验验证表达RANTES基因的腺病毒载体转染细胞后所具有的趋化肿瘤免疫细胞的作用。应用于体外及小鼠体内试验,包括成瘤试验及抑瘤试验,通过观察免疫效应细胞对小鼠体内肿瘤的抑制作用来评价其在肿瘤治疗方面的作用。结果:克隆了人和鼠源性RANTES基因编码序列并成功地构建腺病毒表达载体;功能试验表明由腺病毒表达的RANTES具有趋化肿瘤免疫细胞的作用。体内试验表明该病毒载体可抑制肿瘤细胞成瘤作用,应用于荷瘤小鼠可抑制肿瘤的发展,延长荷瘤小鼠的生存时间。结论:表达RANTES基因的腺病毒载体可显著地趋化免疫细胞到肿瘤局部杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞成瘤作用并延长荷瘤小鼠的生存时间,为肿瘤的生物学治疗提供了新的研究方向。     

IL-2基因与自杀基因联合转移对小鼠红白血病的治疗作用

用腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因体外转染小鼠红白血病FBL-3细胞,结果CD基因转移后该细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性提高了近1000倍,FBL-3细胞有明显的凋亡发生,且观察到明显的旁观者效应.小鼠体内接种FBL-3红白血病细胞后3天,肿瘤局部注射小鼠白细胞介素2(IL-2)基因的表达载体(Ad-IL-2)和Ad-CD腺病毒载体,然后连续10天给予5-FC 300mg/kg行治疗.结果FBL-3皮下肿瘤的生长明显受到抑制,部分小鼠肿瘤消失.联合治疗小鼠的存活期明显大于单用Ad-IL-2治疗组和单用自杀基因CD与5-FC治疗组.体内免疫功能检测表明,经小鼠自杀基因与IL-2联合基因治疗后小鼠脾细胞的CTL杀伤     

联合自杀基因与IL-2基因转移疗法的抗肿瘤效果及其抗肿瘤免疫应答的诱导作用

单用自杀基因疗法或单用细胞因子基因疗法抗肿瘤效果不理想,本研究中我们观察了大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因与白细胞介素2(IL-2)基因联合转移对荷瘤小鼠的治疗效果及其对抗肿瘤免疫的诱导作用。复制荷瘤小鼠模型后在荷瘤部位注射表达CD基因的重组腺病毒(AdCD)及表达小鼠IL-2基因的重组腺病毒(AdIL2),并连续10天、每天1次腹腔注射5氟胞嘧啶(5FC)对荷瘤小鼠进行治疗。结果表明,AdCD/5FC/AdIL2联合基因治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长,并明显延长其生存期(P<0.01)。联合基因治疗组小鼠肿瘤细胞发生明显的坏死,瘤内及瘤周有大量的炎性细胞浸润,瘤内CD4~ 和CD8~ T细胞明显增加,脾细胞NK和CIL杀伤活性明显高于单用AdCD/5FC、对照病毒AdLacZ/5FC或PBS组。实验结果表明,联合应用自杀基因与细胞因子基因治疗可更有效诱导机体的抗肿瘤免疫反应,从而更显著地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL-2基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理分析

目的以腺病毒作为载体，将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移，研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天，肿瘤局部注射表达ＩＬ－２的重组腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ，然后连续１０天给予５－氟胞嘧啶（５－Ｆｃ）３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。结果联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制，小鼠存活期明显长于ＡｄＩＬ－２、ＡｄＣＤ／５－Ｆｃ、ＡｄｌａｃＺ／５－Ｆｃ或ＰＢＳ组。经联合治疗后，小鼠脾细胞的ＮＫ活性和ＣＴＬ杀伤活性明显增强；肿瘤瘤体内ＣＤ４、ＣＤ８细胞浸润增加；肿瘤细胞表达Ｈ－２Ｋｂ和Ｂ７－１分子明显增加。结论联合应用自杀基因和ＩＬ－２基因治疗，一方面可以明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，另一方面可以提高机体对肿瘤细胞免疫应答，增加机体的抗肿瘤作用，是肿瘤基因治疗中一条行之有效的途径。     

腺病毒介导的CD/5FC自杀基因疗法对小鼠结肠腺癌的治疗作用及相关免疫机理的研究

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶CD可以将前体药物5FC代谢为毒性产物5FU,具有抗肿瘤作用.本课题我们观察了腺病毒介导的CD/5FC自杀基因疗法对小鼠结肠癌生长的治疗作用并探讨其作用机理.结果表明,首先,CD/5FC自杀基因疗法小鼠结肠癌CT26体内外生长均具有显著的抑制作用,4O%的荷瘤小鼠经过治疗后长期存活;其次,我们还研究了自杀基因疗法治疗肿瘤时可能涉及的免疫机理.结果发现在以CD/5FC系统治疗结肠腺癌小鼠过程中能在一定程度上诱导出机体的抗肿瘤免疫反应,包括脾脏CT6L活性的增高、肿瘤局部浸润免疫细胞表达,DEC-205、B7-2、I-A~(b,d)分子增加等.本实验结果提示虽然CD/5FC系统可以诱导机体产生一定的抗肿瘤免疫反应,但其程度不够显著.     

携带TIP30与人IFN-γ 基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及抗腺样囊性癌的初步研究

目的:研究锚定表达GM-CSF的小鼠黑色素瘤作为肿瘤疫苗的有效性.方法:GM-CSF基因嵌合GPI信号肽修饰序列实现在B16小鼠黑色素瘤细胞表面的锚定表达,研究锚定修饰的B16细胞于同源C57BL/6小鼠的成瘤性及诱导抗肿瘤免疫的效果.结果:抑瘤实验结果表明,锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞免疫原性增强,成瘤性明显下降;成瘤率为58.8%,而肿瘤对照组为100%.活瘤苗接种实验结果显示锚定修饰的肿瘤细胞可以预防肿瘤的发生,肿瘤发生率仅为20%,说明抗肿瘤的免疫应答有记忆性,能够有效地防止野生型肿瘤细胞的攻击.结论:锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞可以诱导抗特异性的抗肿瘤反应,这种设计可以应用于肿瘤疫苗的研究中.     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL—2基因疗法的肿瘤治 …

以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移,研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天,肿瘤局部 注射表达ＩＬ－２的重要腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达的ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续０天给予５－氟胞嘧啶３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。     

GM—CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

目的研究GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗的可行性.方法通过逆转录病毒载体,将小鼠GM-CSF基因导入EL-4淋巴瘤细胞中,研究EL-4/GM-CSF在同系C57BL/6小鼠中的成瘤性及其诱导抗肿瘤免疫的效果.结果EL-4/GM-CSF细胞在小鼠中的成瘤性下降,50%小鼠无瘤生存.射线灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗能有效地保护野生型肿瘤细胞的攻击,在肿瘤生长的早期对实验性荷瘤小鼠进行治疗,能延长荷瘤宿主的存活时间(33.1±1.8)与对照组EL-4/Wt(23.2±1.5天)比差异有显著性(P＜0.01).基因修饰的瘤苗作用明显增强.结论GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗可诱导较强的抗肿瘤免疫反应,导致肿瘤的部分根除,本实验为基因修饰的肿瘤疫苗的临床应用提出了一定的实验依据.     

糖化重组生存素腺病毒疫苗抗肿瘤作用的实验研究

背景与目的：生存素在调控细胞凋亡和有丝分裂过程中起着重要作用,在正常分化的组织中不表达或表达极低,而在胚胎组织和大部分肿瘤组织中广泛表达,而这一特点为恶性肿瘤的基因治疗提供了很好的靶标.本研究制备糖化重组生存素腺病毒疫苗,观察其抗肿瘤作用并探讨其作用机制.方法：将重组生存素腺病毒和甘露聚糖在氧化条件下偶联,同时建立小鼠结肠癌和Lewis肺癌模型,以糖化重组生存素腺病毒疫苗治疗荷瘤小鼠,观察肿瘤体积和小鼠生存时间.对小鼠肿瘤组织作TUNEL染色观察肿瘤细胞凋亡.为了检测疫苗的保护作用,预先以糖化重组生存素腺病毒疫苗免疫接种小鼠,或合用抗CD4、CD8和NK单克隆抗体阻断相应的淋巴细胞亚群,再接种肿瘤,观察小鼠肿瘤生长情况.结果：糖化重组生存素腺病毒疫苗治疗组小鼠肿瘤生长受到明显抑制,无明显不良反应发生,小鼠的生存时间明显延长,肿瘤细胞凋亡明显增加.同时,糖化重组生存素腺病毒疫苗能诱导小鼠产生抗肿瘤免疫,这一免疫反应依赖于CD4和CD8淋巴细胞,也部分依赖于NK细胞.结论：糖化重组生存素腺病毒疫苗能诱导机体产生特异性的主动免疫反应,诱导肿瘤细胞凋亡,具有明确的抗肿瘤作用,值得进一步研究.     

hMIP-1β基因修饰瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫效应的研究

目的：探讨人巨噬细胞炎性蛋白-1β（hMIP-1β）基因修饰瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫效应。方法：通过重组腺病毒载体介导将hMIP-1β基因导入CT26细胞中,X-gal染色法检测基因转染效率;ELISA法检测hMIP-1β基因修饰CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、NK细胞及未成熟树突状细胞（imDCs）的趋化作用;制备hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗并免疫BALB／c小鼠,观察其诱导免疫细胞的杀伤活性和保护性免疫反应。结果：腺病毒载体可介导hMIP-1β基因转染CT26细胞和表达（X—gal染色的阳性率〉95％）,培养上清中hMIP-1β水平为980pg／mL,并对CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、NK细胞及imDCs有显著的趋化作用,与转染对照基因LacZ的CT26细胞及野生型CT26细胞比较差异均有统计学意义,P〈0．01。hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗免疫小鼠能有效诱导肿瘤特异性CTL活性和非特异性NK活性,产生明显的免疫保护作用,可抵抗肿瘤细胞的再攻击,成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,小鼠生存期延长。结论：hMIP-1β基因修饰瘤苗可诱导产生有效的抗肿瘤免疫保护作用,有希望成为预防肿瘤转移与复发的有效手段。     

过继回输腺病毒介导的白细胞介素10基因转染CTL对机体抗肿瘤免疫功能的增强效应

本研究探讨了白细胞介紊10(IL-10)对小鼠体内抗肿瘤免疫功能的影响。鉴于C26结肠癌细胞转染了IL-10基因后在体内的致瘤性明显下降，本研究构建了一株对C26结肠癌细胞具有杀伤括性的CD8^ CTL并观察了IL-10基因转染的该细胞株对肿瘤的治疗作用。携带IL-10基因的重组腺病毒能有效介导小鼠琳巴细胞的基因转染并使之分泌较高水平的IL-10。IL-10基因转染的CTL过继回输荷瘤小鼠体内能明显增强荷瘤小鼠的体内抗肿瘤免疫功能，使实验性肺转移小鼠肺部转移结节数明显减少．这表明，IL-10对于过继回输的肿瘤特异性CTL的免疫功能具有明显的增强作用。     

CD自杀基因联合淋巴细胞趋化因子基因疗法的肿瘤治疗？…

本研究以腺病毒作为载体，将大肠杆菌胸嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因与小鼠淋巴细胞趋化因子（Ｌｔｎ）基因体内联合转染，观察了其抗肿瘤效应并分析了免疫机理。小鼠皮下接种结肠腺癌ＣＴ２６细胞后３天，肿瘤局部注射表达Ｌｔｎ的重组腺病毒ＡｄＬｔｎ和表达ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ，然后连续１０天给予５－氟胸嘧啶（５－ＦＣ）３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗，结果表明，联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长受到明显抑制，小鼠存活期明     

MIP-1β基因修饰增强肿瘤相关抗原致敏树突状细胞的抗肿瘤免疫效果

目的:探讨通过增强树突状细胞(dendritic cells,DC)与T细胞的相互作用来进一步增强DC介导的抗肿瘤免疫效果.方法:体外培养的小鼠骨髓DC体外经携带人MIP-1β基因的重组腺病毒(adenovirus expressing human macrophoge inflammatory protein-1 beta,AdhMIP-1β)转染后(MIP-1β-DC),用小鼠CT26结肠腺癌细胞相关抗原冲击致敏,然后免疫正常同系小鼠,观察其体内诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的保护性免疫反应;通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分子在DC诱导抗肿瘤免疫应答中的作用.结果:经抗原致敏的MIP-1β-DC能更有效地诱导特异CTL活性,能使免疫动物产生更有效的免疫保护作用,抵抗肿瘤细胞的攻击.通过对其抗肿瘤免疫机理的分析发现,CD4 、CD8 T细胞共同参与了经抗原致敏的MIP-1β-DC介导的抗肿瘤免疫反应,是主要的抗瘤效应细胞,NK细胞作用不明显.结论:通过基因修饰增强树突状细胞对T细胞的体内趋化活性,能更有效地诱导抗肿瘤免疫反应,为树突状细胞介导的肿瘤免疫基因治疗开辟了新的途径.     

重组腺病毒鼠CD40L对小鼠淋巴瘤治疗和预防作用的体内研究

目的:探讨重组腺病毒鼠CD40-ligand基因(Adv-mCD40L)对小鼠淋巴瘤的免疫治疗作用及免疫预防作用。方法:构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,体外转染小鼠B淋巴瘤细胞(A20细胞)。流式细胞术检测A20细胞转染前后表面CD80、CD86、CD40L(CD154)、CD40表达情况。在体内实验中,治疗组首先建立小鼠A20荷瘤模型,分别于肿瘤内多点注射Adv-mCD40L和Adv;预防组小鼠预先分别接种负载A20细胞抗原的Adv-mCD40L和Adv,免疫后再次接种具有活性的A20细胞,均以生理盐水作为对照,观察小鼠成瘤时间及肿瘤生长情况。结果:体外转染mCD40L基因24h内CD154和CD40表达水平改变,48h后A20表达CD80、CD86增强。经Adv-mCD40L免疫后的小鼠成瘤时间较其他组明显延迟。经mCD40L基因治疗的小鼠均可见瘤体生长速度明显受抑,肿瘤大小分别与经Adv及NS治疗的小鼠比较,有显著差异(P<0.05)。结论:转染mCD40L基因可以增强A20表面协同刺激分子的表达,增强A20细胞的免疫原性,激活机体的抗肿瘤免疫,延缓成瘤时间,抑制肿瘤生长。     

复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的研究

目的:探讨人类复制缺陷型重组腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的可行性和效果。方法:利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)中,观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用,及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用。结果:1)携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达;2)将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响,但能显著提高细胞表面MHC-I类抗原的表达;3)将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠,其体内致瘤性明显降低,且对对侧野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用;4)瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。结论:利用人类复制缺陷型腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤是可行的,并具有较好疗效,提示用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

肿瘤抗原触发的M-CSF和/或IFN-γ基因转染的巨噬细胞抗肿瘤转移作用及其机制研究

本部分实验中,我们将腺病毒介导的M-CSF和/或IFN-γ基因转染的巨噬细胞与肿瘤抗原共孵育,以发挥其抗原提呈功能而使巨噬细胞在回输体内前就获得诱导特异性抗肿瘤免疫功能的能力,进一步用此巨噬细胞治疗了实验性肺转移黑色素瘤小鼠,观察了其疗效并检测了经治疗后荷瘤小鼠的体内抗肿瘤免疫功能.     

腺病毒介导反义VEGF降低肿瘤诱导免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果

目的：本研究旨在探讨腺病毒介导的反义VEGF降低肿瘤诱导的免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果。方法：用反义VEGF修饰及反义VEGF与IL-2基因共同修饰MM45T，Li小鼠肝癌细胞，然后观察修饰后的肿瘤细胞的致瘤性；并在体内观察反义VEGF与IL-2基因诱导肝癌模型小鼠肿瘤细胞的凋亡，以及肿瘤组织中CD4^ ,CD8^ 细胞浸润情况。结果：反义VEGF降低了肝癌细胞MM45T.Li的致瘤性；增加了肿瘤组织周围CD4^ ,CD8^ 细胞浸润，改善了模型小鼠的免疫抑制状态，提高了IL-2抗肿瘤效果。结论：反义VEGF不仅可抑制新生血管的生成，而且可降低肿瘤诱导的免疫抑制，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别，与IL-2免疫基因治疗相结合可明显提高对肿瘤的杀伤效果。