内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coliJM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率最高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

内源性血管生成抑制因子Arresten的克隆表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten的原核表达体系,并于大肠杆菌中初步表达。方法从健康产妇胎盘组织中提取总RNA,经反转录．聚合酶链式反应扩增出Arresten基因,将基因克隆人克隆载体（pMD19-T）中,测序确认。酶切后插入表达载体pBV221,转入大肠杆菌JM109进行温控诱导表达,经蛋白质免疫印迹技术（Western-blot）检测Arresten蛋白的表达。结果酶切鉴定证实Arresten基因正确地插入表达载体中。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析,重组体Arresten在大肠杆菌中获得表达,分子量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的30％。经Western blotting检测表明该异源重组蛋白具有添加的亲和纯化标签多聚组氨酸标签抗原活性。结论成功构建了有效的原核表达体系pBV221-Arresten。     

AcAP5蛋白N端片段的表达、纯化与活性评价(英文)

犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma anticoagulant peptide 5,AcAP5)N端40个氨基酸片段(N40)含有与FXa结合的结构域。为研究N40的FXa抑制作用,我们克隆、表达和纯化了N40,并检测其生物活性。用PCR扩增N40基因;将PCR产物克隆至原核表达载体pET-30a中,构建质粒pET30a-N40;将其转化入大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定,经过镍柱亲和层析纯化,用BCA法进行蛋白定量,测定该蛋白抑制FXa的活性。限制性酶切鉴定和基因测序结果显示重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示目的蛋白在E.coli.BL21(DE3)中为可溶性表达,亲和层析纯化后获得了纯度约90%的蛋白,经活性鉴定该蛋白确有抑制FXa的活性。     

蛋白转导结构域4-铜/锌-超氧化物歧化酶融合蛋白的制备及其穿细胞膜的功能研究

目的 拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力.方法 设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni+2亲和层析、收集目的蛋白.融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力.结果 通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致.设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GEN-BANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒.并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/Zn-SOD具有良好水溶性.SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合.融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性.结论 成功地构建了PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了基础.     

融合头的改变对抑制重组抗菌肽毒性的影响

为进一步完善G13结构域的原核表达系统,人工合成编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pET28a中,构建的重组质粒pET28a-G13转化于E.coli BL21(DE3)中.另外对pET28a-G13进行突变,改变其G13片段N端上游处的融合头的电荷数,转化于E.coli BL21(DE3)中.构建pThiohisA突变体并与pET28a-G13共转化于E.coli BL21(DE3)中.用诱导剂诱导所构建的各个工程菌,然后比较A_(600)值变化及蛋白表达量,分析不同的融合头对G13毒性抑制效果,发现融合头对G13毒性抑制效果与其净负电荷数及酸性氨基酸的相对位置有关.     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

猪干扰素-γ cDNA的克隆和原核表达

目的克隆猪的干扰素-γcDNA,并进行原核表达,以实现猪干扰素-γ的大量生产。方法收集转染细胞(CHO-PCI-neo-PoIFNγ),用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA,并通过RT-PCR的方法扩增获得猪干扰素-γcDNA基因。将获得的猪干扰素-γcDNA基因克隆入原核表达载体pBV220中,组装成原核表达载体pBV220-cPoIFNγ。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株DH5α和BL21中,温度诱导培养后,进行SDS-PAGE实验检测。结果特异表达带约在17KD的位置,并证实在菌株DH5α和BL21中的表达量没有明显的差异,其表达量都约占细菌总蛋白的15%。结论成功地进行了猪的干扰素-γcDNA,并进行原核表达,为猪干扰素-γ的大量生产提供了可能。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

重组人血管生长素基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达重组人血管生长素 (rhANG)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵 ,研究不同宿主菌对表达rhANG的影响 ,同时对培养基、诱导时期、诱导时间和初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用E .coliCDH为宿主菌 ,在SOB培养基中培养至A6 0 0nm 为 0 .5～ 0 .6时 ,诱导表达 5h ,rhANG表达量最高达 30 %。重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高rhANG的表达量 ,为发酵规模的扩大奠定了基础     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

胆管癌相关FXYD6基因功能区在大肠埃希菌表达的初步研究

目的对胆管癌相关基因FXYD6基因的功能区进行克隆和表达,以便进一步展开该基因功能研究。方法借助生物信息学方法分析FXYD6基因,设计FXYD6基因信号肽剪切后功能区蛋白体外表达序列,并将其克隆到pBV220表达载体上,继而以大肠埃希菌为表达系统,使功能区蛋白（不含信号肽）获得体外表达。结果该基因主要功能位点位于18～95 aa。PCR扩增出剪切掉信号肽序列的功能区序列（即包含18～95 aa的肽链段）,并成功构建pBV220/FXYD6-ex基因功能区重组表达质粒克隆,其在大肠埃希菌DH5α中表达量最高,表达产物主要以包涵体形式存在。结论获得胆管癌相关FXYD6基因融合蛋白表达产物,为后续研究打下基础。