人IFN—γcDNA逆转录病毒载体的构建及其在Lewis肺癌细胞的稳…

应用分子克隆技术构建了含８４３ｂｐ的全长人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ的逆转录病毒表达载体Ｎ２／ＩＦＮ，采用磷酸钙共沉淀方法转染包装细胞ΨＣＲＥ和ΨＣＲＩＰ，并能得到较高滴度的含病毒颗粒上清。然后应用ΨＣＲＩＰ细胞培养上清的复制缺陷性病毒颗粒感染Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞（ＬＬＣ），经过Ｇ４１８筛选克隆得到了一株能稳定分泌ＩＦＮ（６４００Ｕ／ｍｌ）的克隆，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹证实ＩＦＮ－γ基因已插入ＬＬＣ基因组。结     

逆转录病毒介导的人TNF在人肝癌细胞系（SMMC）中的表达

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含人ＴＮＦａ基因的重组逆转录病毒载体Ｌ－ｔｎｆＳＮ。磷酸钙沉淀法将重组载体引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。应用这一重组病毒感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从转导的细胞ＤＮＡ中扩增出ＴＮＦａ基因片段，提示目的基因完整地整合在细胞基因组中。测定转导细胞培养上清中ＴＮＦａ活性，结果显示ＴＮＦａ有相对稳定的表达（１５０～３７０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／２４小时）。实验还表明转导细胞的体外生长能力无明显变化，但是其在裸鼠中的致瘤性却明显降低，提示逆转录病毒介导ＴＮＦａ基因对人原发性肝场可能有一定的治疗作用。     

痘苗病毒载体与肿瘤基因治疗（下）──重组痘苗病毒载体介导的肿瘤基因治疗

目前采用同源重组构建了多种表达外源基因的重组痘苗病毒载体，包括ＩＬ－２，ＩＬ－刀，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＦＮα，ＩＦＮγ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ－１０等细胞因子基因及ｐ９７，ＣＥＡ，ＭＵＣ１等肿瘤抗原基因，并应用于肿瘤基因治疗的体内外实验取得了明显的疗效。应用痘苗病毒载体进行ｉｎｖｉｖｏ基因治疗可望成为肿瘤基因治疗的一种新模式。     

可溶性人干细胞因子基因导入真核细胞及其表达

本文构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７－ＳＣＦ，其病毒效价为２．４×１０５～８．５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干祖细胞和ＮＩＨ３Ｔ３细胞。应用ＰＣＲ、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光一直接酶标法检测上述细胞中人ＳＣＦ基因的转染和表达，结果表明逆转录病毒载体介导转染的ｒｈ～ＳＣＦ基因在真核细胞中获得有效的表达。并将转有外源基因的人骨髓细胞进行体外液体长期培养（ＬＴＣ），观察造血干祖细胞增殖分化期间基因的表达情况。     

痘苗病毒载体与肿瘤基因治疗（下）——重组痘苗病毒载体介导的肿瘤基…

目前采用同源重组构建了多种表达外源基因的重组痘苗病毒载体，包括ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＦＮα，ＩＦＮγ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ－１０等细胞因子基因及ｐ９７，ＣＥＡ，ＭＵＣ１等肿瘤抗原基因，并应用于肿瘤基因治疗的体内外实验取得了明显的疗效。应用痘苗病毒载体进行ｉｎ ｖｉｖｏ基因治疗可望成为肿瘤基因治疗的一种新模式。     

逆转录病毒载体介导入GM—CSF基因转染肿瘤细胞

应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ介导入ＧＭ－ＣＳＦ基因转染肿瘤细胞获得表达。经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将含有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组逆转录病毒功茶ｐＺＩＰ－ＧＭ转染兼性病毒包装细胞系ＰＡ３１７，继之用病毒睡获感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１和人胃癌ＢＧＣ－８２３，经ＧＭ－ＣＳＦＪ依赖细胞株ＴＦ１活活和双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ法测定表明：人ＧＭ－ＣＳＦ基因在人肿瘤中获得稳定高效表达。     

γ—干扰素基因修饰人肿瘤细胞的研究

将人γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）念信号肽ｃＤＮＡ构建入可表达逆转录病毒载体质粒ｐＬＸＳＮ，体外包装成缺陷型逆转录病毒后分别感染人胃癌细胞株ＭＫＮ－４５及人肝癌细胞株ＨＨＣＬ，经筛选后得到ＩＦＮ－γ基因修饰的肿瘤细胞，流式细胞仪分别检测了基因修饰肿瘤细胞的细胞周期及ＨＬＡ－Ｉ，Ⅱ类抗原表达；裸鼠皮下接种观察其致瘤性是否变化；结果发现经ＩＦＮ－γ基因修饰后细胞增殖减慢；ＨＬＡ－Ｉ，Ⅱ类表达都有不同程度的增     

脂质体介导IFNγ基因治疗小鼠肝癌的研究

以大肠杆菌β－ｇａｌ基因为报告基因，优化了３种阳离子脂质本的转染条件，评估了其转染效率。用构建的含腺相关病毒反向末端重复序列的质粒表达载体，经Ｄｏｓｐｅｒ介导将小鼠ＩＦＮγ基因导入ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ细胞，体外有效地表达ＩＦＮγ。瘤体内注射Ｄｏｓｐｅｒ－ｐＡＩ－ｍＩＦＮγ复合物可明显报制肿瘤生长，荷瘤小鼠生存期延长。     

导入小鼠IFN-γ基因的肿瘤细胞的建立和鉴定

从小鼠脾细胞提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ ＰＣＲ得到含信号肽的小鼠γ 干扰素（ｍＩＦＮ γ）全长ｃＤＮＡ,经测序鉴定后将其克隆到含标记基因ＮｅｏＲ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中,采用脂质体法将其导入包装细胞ＰＡ３１７,经过包装,用含ｍＩＦＮ γ基因的缺陷型病毒上清感染小鼠肝癌细胞,经Ｇ４１８筛选建立起ｍＩＦＮ γ基因修饰株。ＰＣＲ、ＲＴ ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示有ｍＩＦＮ γ及标记基因的转入和表达。生物学活性测定也表明该基因修饰株细胞培养上清中有一定活性的ＩＦＮ γ分泌。     

携带hIL-2cDNA的逆转录病毒载体的构建及其在人肝癌细胞中的特异表达研究

将人白细胞介素２（ｈＩＬ-２）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＭＮＳＭ的ＰＬ位点　，分别构建了转录受ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子调控的重组逆转录病毒载体ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ。用脂质体转染法将ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ分别转导ＰＡ３１７包装细胞，测质粒转染率为（５～２０）×１０~(－３)克隆／μｇＤＮＡ·１０~６细胞，病毒感染率为（５．４～４５０）×１０~４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌细胞、肾癌细胞和黑色素瘤细胞，Ｎｅｏ~Ｒ克隆经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ转入人肿瘤细胞并整合，　Ｒ　ＮＡ斑点杂交及ＩＬ－２活性表达分析证明，人甲胎蛋白增强子可促进异源启动子启动ｈＩＬ－２ｃＤ－ＮＡ在合成甲胎蛋白的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。该研究对肝癌特异性免疫增强基因治疗有重要意义。