气虚证H22荷瘤小鼠甲状腺独特上下调基因的表达特征

目的：揭示荷瘤小鼠气虚证甲状腺基因表达的特征。方法：采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,应用GeneChip Mouse Exon1.0STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候甲状腺基因表达的差异,重点关注早期气虚证上下调且表达量高的基因。结果：气虚证荷瘤小鼠甲状腺独特上调基因有33个,其中表达较高的基因6个,分别为Mta2d1、Comd3、Ucp1、Psmc6、LOC665964、Cyp2j11;独特下调的基因有31个,其中正常组表达较高的基因有5个,分别为Lcn2、Arntl、Mansc1、Hk1、Rpl29。结论：肿瘤发生后,H22荷瘤小鼠甲状腺存在大量的基因表达改变,其中早期气虚证独特上调或下调基因,可能与气虚证本质有关。     

H22荷瘤小鼠肿瘤发生后睾丸表达改变显著的基因

目的:探讨H22荷瘤小鼠肿瘤发生后睾丸基因表达谱改变的特征。方法:采用荷瘤小鼠标准化四诊及辨证方法,以及Gene Chip Mouse Exon1.0 STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠睾丸组织早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证3个阶段4个证候睾丸基因表达谱的差异,重点关注肿瘤发生后一致上调或下调明显且表达量大的基因。结果:肿瘤发生后三个阶段一致上调的基因5个;一致下调的基因12个,其中7个与性激素和生殖有关;早期上调、中期和中晚期下调的基因1个;早期和中期上调、中晚期下调的基因3个。在这些基因中,Saa3在晚期气阴阳虚证表达上调了近60倍,Abpg、Pip、Car6在早期邪毒壅盛证表达上调了40~80倍,值得关注。结论:肿瘤发生后荷瘤小鼠睾丸基因表达的改变以下调为主,性激素合成与生殖受到影响;一些表达显著改变的基因值得进一步研究。     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠甲状腺独特上调和下调基因的检测

我们以往的研究一再发现,荷瘤小鼠在肿瘤发生后,会自发形成证候及其演变,早期以邪毒壅盛证、气虚证多见,且发现邪毒壅盛证动物预后差,带瘤生存时间短.鉴于学术界以往的研究观察到中医证候的形成与甲状腺密切相关,那么,邪毒壅盛证发生时,甲状腺是否存在独特的基因表达特征,是否与该证候形成有关?因此,我们通过业已建立的小鼠四诊工作站及其系列标准[1-2],对H22荷瘤小鼠进行辨证,筛选出早期邪毒壅盛证、气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证等4个常见证型,继而采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术对以上各证候荷瘤小鼠甲状腺等组织的基因进行了检测,本文重点报道邪毒壅盛证甲状腺独特上调与下调且表达量较高的基因.     

正常与不同证候H22荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因

目的:揭示正常与不同证候昆明种荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因.方法:采用昆明种正常小鼠与腋下接种H22腹水瘤细胞的小鼠,取接种肿瘤后第8天(早期)邪毒壅盛证与气虚证、第21天(中期)阳气虚证、第29天(中晚期)气阴阳虚证荷瘤小鼠与正常对照组小鼠肾上腺,抽提RNA、纯化及Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array检测.结果:筛选到402条高表达的基因,其中有1个及以上组别芯片读数计算值大于5 000的有88条.这些基因主要参与代谢和基因表达的调控,部分参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导,以及部分参与免疫、细胞周期和细胞凋亡、发育:另有许多基因功能未知.结论:这些在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达的基因,可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意义;鉴于气虚证荷瘤小鼠这些基因大多表达量低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠,反映出气虚证候的本质及特征;再次,4个不同证候荷瘤小鼠肾上腺这些基因表达差异分别有集中的趋势,印证了中医学“同病异证“的理论及其本质,要求辨证论治.     

阳气虚证H22荷瘤小鼠胸腺独特上、下调的高表达基因

目的:观察荷瘤小鼠中期阶段阳气虚证胸腺独特上调和下调的高表达基因。方法:综合采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测在肿瘤中期阳气虚证H22荷瘤小鼠胸腺组织基因的表达,筛选独特上调或下调者,并重点关注表达量高的基因。结果:肿瘤中期阳虚证荷瘤小鼠胸腺独特上调的基因达260个,下调仅15个。结论:(1)荷瘤小鼠发展到中期的阳气虚证,其胸腺虽然已出现萎缩的现象,但仍处于代偿阶段;(2)Hey2、Hivep2、Stat6、Prdm1、Avpr1a、Ralb、Trdn、Mcmdc1、Olfr1351、Avil、Gns、Ros1等高表达上调的基因,可能与促进T细胞的分化成熟有关;(3)St8sia4、Nxph4、Spred2、Bcas3、Tbcd、Ctns等独特下调基因标志着胸腺内基因表达调节在整体上出现了紊乱,可能预示着胸腺衰竭阶段的到来。这些构成了肿瘤中期阶段阳气虚证荷瘤小鼠胸腺基因表达层面的特征。     

不同证候小鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴基因表达的特征

目的：观察不同证候小鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPTA）相关主要已知基因表达的特征。方法：采用小鼠计量化四诊和辨证方法、及GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray等技术,观察正常偏气虚证小鼠、早期邪毒壅盛证和早期气虚证荷瘤小鼠HPTA相关基因表达差异。结果：（1）正常小鼠气虚证者,甲状腺机能减退,Atp1a1、Atp1a2、Atp1a3、Atp1b1、Atp1b2、Pax8、Tg、Tpo、NIS等与甲状腺素合成有关基因的表达水平一致下降;而垂体、下丘脑处于积极的代偿之中,TRH、TSH等激素表达增加。（2）肿瘤发生后的早期,荷瘤小鼠亦出现甲状腺机能的减退,垂体、下丘脑亦处于积极的代偿之中,TRH、TSH等激素表达增加。但是,该阶段邪毒壅盛证小鼠,垂体已出现失代偿的征兆,TSHb的表达量已显著低于同期的气虚证以及正常气虚小鼠。结论：甲状腺机能减退可能是气虚证发生的重要基础,而非下丘脑和垂体。荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证垂体继发的失代偿表现,可能与该证候荷瘤小鼠带瘤生存期短、预后差有关。     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因的表达特征研究

目的揭示H22荷瘤小鼠邪毒壅盛证肿瘤组织基因表达的特征。方法采用GeneChipMouseExon1．0STArray等技术及芯片分析方法,观察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期气虚、中期阳气虚及中晚期气阴阳虚证肿瘤组织基因表达的差异。结果筛选到邪毒壅盛证独特性高表达的基因32个,其中包括Tete3、Phf7、Ldhc等参与睾丸发育、精子或卵子发生的基因22个,Adipoq、Nream、Tnfaip6等与肿瘤有关的基因4个,以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6个。筛选到邪毒壅盛证独特性低表达的基因2个,有Cort和LOC668417。结论邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织中存在大量独特性表达的基因,可能是该证候与其他证候区别的内在特征。     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠胸腺独特上调的高表达基因

目的 观察邪毒壅盛证荷瘤小鼠胸腺基因表达的特征.方法 综合采用荷瘤小鼠及其标准化辨证方法,采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array检测不同证候H22荷瘤小鼠胸腺组织基因的表达,并分别筛选2006年及2009年两批数据中邪毒壅盛证独特高表达的基因,进行理论研究.结果 2006年、2009年早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠胸腺组织一致独特上调的基因108个,取各自最高表达的15个基因,有8个重叠:Trim30、Sept6、Mcm3、Supt16h、Vps35、Smc3、Rsl1d1、Pa2g4,另分别有Smc1a、Eif3s10、Phf6、Sesn1、Iws1、Lin7c、Itch,以及Tax1bp1、Ifi204、Pnn、Ptbp2、Ascc3、Ddx10、Luc7l2等非重叠基因,这些基因主要涉及细胞的增殖、基因的表达与调控.结论 邪毒壅盛证荷瘤小鼠胸腺高表达的基因多涉及促进基因的表达与复制,这与该证候肿瘤增长迅速相关,提示胸腺尚处于被动且积极的免疫代偿状态;鉴于与邪毒壅盛证同期的气虚证,以及与其它对照比较,这些基因独特上调,提示荷瘤小鼠同病异证在胸腺层面是有其物质基础的.     

不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤ABC转运蛋白家族基因转录特征

目的:观察不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤组织ABC转运蛋白家族基因表达的特征。方法:对来源于早期邪毒壅盛和单纯气虚、中期阳气虚和中晚期气阴阳虚四种证候小鼠H22肿瘤组织4张Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray数据标准化处理后,筛选其中的ABC转运蛋白基因进行差异分析。结果:从芯片中共筛选出与ABC转运蛋白有关的基因47个,以邪毒壅盛小鼠肿瘤基因转录最活跃,气虚次之,阳气虚最低;四种常见证候间共有25个基因转录具有明显差异;Abce1和Abcf1等7个基因中在四种常见证候肿瘤中转录水平最高。结论:Tap1(Abcb2)和Abcd2等6个高表达基因可能是邪毒壅盛型小鼠肿瘤增长快的重要因素;不同证候荷瘤小鼠肿瘤组织中的ABC转运蛋白基因转录既存在一定共性又存在很大差异,进一步证明了H22荷瘤小鼠证候客观存在的物质基础,为中医辨证论治提供分子依据。     

不同证候荷瘤小鼠睾丸差异表达基因的特征

目的：观察荷瘤小鼠肿瘤发生后不同阶段4个常见证候睾丸独特上、下调的基因。方法：采用荷瘤小鼠及其标准化四诊与辨证方法,及GeneChip Mouse Exon ST 1.0 Array等技术,检测早期邪毒壅盛证及气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证睾丸基因的差异表达,重点关注那些表达较高的基因。结果：共捡出独特上调和下调的基因28个,其中有5个基因在不同证候中上下调不一致。肿瘤发生后早期邪毒壅盛证上调的基因8个：Abpg、Pip、Muc10、Car6、2310057J18Rik、K1k1b3、K1k1、Wfdc12,下调的基因5个：Spcs1、Dtx3、Rasa3、Sec1113、F5;早期气虚证上调的基因4个：Gpx5、Wbp5、Lcn5、Ap1s2,下调的基因1个：K1k1b26;中期阳气虚证无上调基因,下调基因3个,分别为K1k1b27、Spag5、Gpx5（在早期气虚证上调）;中晚期气阴阳虚证上调基因2个,分别为Saa3、S100a8,下调基因5个;Abpg、Pip、Muc10、Car6、Cuzd1（前4个在邪毒壅盛证上调）。结论：荷瘤小鼠在早期阶段,邪毒壅盛证与睾丸基因表达的紊乱关系较为密切;中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证睾丸基因以下调为主,提示中、晚期虚实夹杂证的荷瘤小鼠其睾丸功能下降。     

甲状腺激素释放相关水解酶基因在H22肝癌小鼠早期不同证候中的表达特征

目的：研究甲状腺激素释放相关主要水解酶基因在H22肝癌小鼠早期不同证候中的表达特征。方法采用标准化诊法技术筛选出早期邪毒证、气虚证H22肿瘤小鼠,先采用Affeymetrix基因芯片技术,初步获得甲状腺球蛋白（Tg）,即甲状腺激素前体蛋白,及其相关的水解酶基因表达特征,并筛选主要差异表达基因;进而重复实验,RT-PCR检测主要差异表达基因的变化,同时ELISA检测血清甲状腺激素T3和T4水平。结果①初次实验芯片结果,Tg及其释放相关重要的水解酶：组织蛋白酶B（Ctsb）、组织蛋白酶D（Ctsd）、组织蛋白酶l（Ctsl）、天冬氨酸肽酶（Napsa）、三肽酶I （Tpp1）在肝癌小鼠早期邪毒证、气虚证呈下调趋势[Tg（邪毒0.77、气虚0.84）、Ctsb（邪毒0.83、气虚0.91）、Ctsd（邪毒0.79、气虚0.95）、Ctsl（邪毒0.95、气虚0.65）、Napsa（邪毒0.78、1.05）、Tpp1（邪毒0.75、0.94）],以邪毒证下降尤甚。②酶联免疫吸附试验（ELISA）表明,在邪毒证[T3为（1.519±0.162）ng/ml、T4为（2.194±0.305）μg/dl]和气虚证[T4为（4.366±0.727）μg/dl]均出现下调,且邪毒证尤甚（P＜0.01）,与两批次Tg转录水平的变化相一致;③对Ctsb等基因的RT-PCR检测结果表明,Tg（邪毒0.22、气虚0.38）、Ctsb（邪毒0.31、气虚0.55）、Ctsd（邪毒0.36、气虚0.78）、Napsa（邪毒0.24、气虚0.59）基本一致,Ctsl（邪毒1.24、气虚2.11）和Tpp1（邪毒2.85、气虚0.85）虽趋势相同,但在气虚证表达量大于同期邪毒证上则始终一致。结论综合不同批次实验结果,H22肝癌小鼠早期甲状腺功能受到抑制,且邪毒证抑制程度更重。     

荷瘤小鼠早期邪毒壅盛和气虚证睾丸下调的基因

目的:观察H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛和气虚证睾丸组织一致下调的基因。方法:采用荷瘤小鼠标准化四诊和辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和早期气虚证睾丸组织基因表达谱的差异,重点关注早期阶段2个证候一致下调且表达量较大的基因。结果:筛选出早期邪毒壅盛和气虚证一致下调的基因共150个,其中有11类可以简单归类的基因;气虚与邪毒壅盛证这些基因的表达量差异不大,前者略高于后者;中晚期荷瘤小鼠这些基因表达接近正常对照组,甚至上调。结论:肿瘤发生的早期睾丸基因改变以下调为主,一些基因涉及精子发生,提示荷瘤小鼠生殖受到影响;鉴于两个证候这些基因表达的差异不大,及中晚期表达有增加趋势,提示这些基因下调可能与肿瘤早期应激有关;多数基因在睾丸组织中的功能还不清楚,提示有大量探索工作。     

荷瘤小鼠虚证、实证垂体基因表达的差异

目的:揭示荷瘤小鼠实证与虚证垂体基因表达的差异.方法:采用四诊计量检测方法及计量辨证方法,运用GeneChipMouseExon1.0 STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候垂体基因表迭的差异,重点关注那些表达量大、差异显著的基因.筛选出邪毒壅盛证较其他三个证候一致上调或下调的基Igl.结果:筛选出邪毒壅盛较其他三证一致上调的基因121个.介绍了邪毒壅盛证芯片读数大于1500的9个基因:Gabra6、DOH4S114、Ales2、Pvalb、Plpl、Itprl、Narg2、LOC627016、Gpm6b;一致下调的基因340个.介绍了正常小鼠芯片读数大于1500的21个基因:Abpg、Pip、Dlkl、Car6、Eif3s5、Gnb2、Pcskln、Aplpl、S1c22a17、Dnpep、Rnfl87、IOC639100、Rablb、Aldh2、Pten、Tapbp、2310044H10Rik、Cxxc5、Gamdl、Renl、Lrpll.结论:H22荷瘤小鼠的实证与虚证.其垂体基因存在大量的表达差异.其中部分可能是实证与虚证的标志基因.     

同病异证H22肝癌小鼠甲状腺AC-cAMP信号通路基因差异表达的特征

目的 观察同病异证H22肝癌小鼠甲状腺AC-cAMP信号通路基因差异表达的特征.方法 采用小鼠计量化四诊和辨证方法及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,观察肿瘤邪毒证、气虚证甲状腺激素生成和释放相关AC-cAMP信号通路及相关基因表达特征.结果 ①一些基因相对关键,Tg和转录因子Pa...     

同病异证H22肝癌小鼠肿瘤组织细胞凋亡通路基因差异表达的特征

目的:观察昆明种H22肝癌小鼠邪毒壅盛证与气虚证肿瘤组织细胞凋亡通路基因表达特征,探讨中医同病异证发生的物质基础。方法:采用小鼠计量化辨证方法,筛选出瘤早期邪毒壅盛证与气虚证同病异证H22肝癌小鼠,采用Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array检测肿瘤组织细胞凋亡通路相关基因表达的特征。结果:依据KEGG数据库细胞凋亡通路,筛选出芯片数据中匹配的33个基因,发现(1)TNF-α和IL-1依赖的细胞凋亡信号通路总体上不利于邪毒壅盛证小鼠肿瘤细胞的凋亡;(2)IL-3依赖的细胞凋亡信号通路总体上反似有利于邪毒壅盛证小鼠肿瘤细胞凋亡;而(3)线粒体介导的细胞凋亡信号通路,邪毒壅盛证小鼠一致表达下调,提示不利于其细胞凋亡。结论:邪毒壅盛肝癌小鼠肿瘤细胞恶性增殖程度高,可能与线粒体介导的细胞凋亡信号通路系列相关基因表达轻度抑制有关。