日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫Tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-SjTsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了Tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。     

日本血吸虫钙网蛋白基因的克隆、表达及鉴定

目的 为了寻找日本血吸虫病新的免疫学候选分子,克隆日本血吸虫钙网蛋白(calreticulin,CRT)编码基因,并进行表达、鉴定.方法 以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjCRT编码基因,并与pGEM-T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与表达载体pET28a(+)连接,PCR和双酶切鉴定后测序.IPTG诱导表达重组质粒pET28a-SjCRT,进行SDS变性蛋白质电泳和Western-blot分析,用亲和层析纯化获得重组蛋白.结果 成功地构建了重组质粒pET28a-SjCRT,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blotting分析表明,该重组蛋白能被血吸虫感染小鼠阳性血清识别.亲和层析纯化获得SjCRT重组蛋白.结论 重组质粒SjCRT的构建和重组蛋白的表达和纯化,为进一步探讨其在血吸虫病疫苗和诊断中的应用奠定了基础.     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用PCR技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到pcDNA3质粒，在HeLa细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（618bp），构建了真核表达质粒pcDNA3／ESG，在HeLa细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达24．4％，分子量约为22kDa，dot－ELISA和Westernblot分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的BALB／c小鼠脾细胞增殖，其转化率达44．57％。结论：成功地构建重组质粒pcDNA3/ESG, 并在HeLa 细胞中高效表达卵壳蛋白基因, 表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。     

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白（SjTollip）基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆和表达日本血吸虫BBC1（SjBBC1）基因，为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5．0引物设计软件自行设计引物，PCR扩增SjBBC1基因，将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后，亚克隆人pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp，与预期大小相符。将该基因克隆人原核表达载体pQE30，表达蛋白分子质量单位约为23．6ku，并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30／SjBBC1原核表达重组体载体，表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫tetraspanins胞外环2编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫（中国大陆株）tetraspanins胞外环2（EC-2）编码基因（Sj-tsp-2）。方法在日本血吸虫基因组中筛选获得与曼氏血吸虫tetraspanins基因胞外环2结构域序列同源的片段，经过一定修饰，采用全基因合成方式获得目的基因片段，构建重组质粒pET-32a-Sj-tsp-2，并转化至BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达，在非变性条件下亲和纯化融合蛋白。结果通过核苷酸测序证实重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明，融合蛋白和目的肽段与预计太小基本一致。Western blotting结果说明，该融合蛋白具有良好的免疫原性。结论本实验成功表达了日本血吸虫Sj-tsp-2基因，并纯化获得其融合蛋白，为进行动物保护性实验奠定了基础。     

日本血吸虫四跨膜蛋白6编码基因的克隆、表达与鉴定

目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Tsp6样融合蛋白。 方法 设计特异性引物,PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Tsp6样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pET28a(+)表达载体,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21中,并用IPTG对该重组菌诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。 结果 PCR法扩增出一条大小约为702bp大小的Sj-Tsp6样蛋白的DNA片断,将目的基因转入表达质粒pET28a(+),经SDS-PAGE可见一条约28kDa大小的带有HIS标签的融合蛋白条带,此蛋白可被血吸虫病兔血清所识别。 结论 本实验成功克隆日本血吸虫Sj-Tsp6 样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆和表达日本血吸虫BBC1(SjBBC1)基因,为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5.0引物设计软件自行设计引物,PCR扩增SjBBC1基因,将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后,亚克隆入pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp,与预期大小相符。将该基因克隆入原核表达载体pQE30,表达蛋白分子质量单位约为23.6ku,并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30/SjBBC1原核表达重组体载体,表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

日本血吸虫Mago nashi基因的表达及其抗体的制备

目的 获得日本血吸虫Mago nashi(SjMago)基因的原核表达蛋白并制备多克隆抗体.方法 以童虫cDNA文库为模板,PCR方法扩增该基因,将其亚克隆人原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白,用含重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用Western blot和ELISA法鉴定抗体的特异性和效价.结果 成功重组SjMago基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达相对分子质量约17×103的目的蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶40 960,Westernblot证实有特异性目的蛋白条带存在.结论 成功获得了原核表达的SjMago基因,制备出特异性的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础.     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

日本血吸虫肌动蛋白cDNA的克隆表达及其免疫保护功能

根据曼氏血吸虫肌动蛋白cDNA SmAct2设计一对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT－PCR法扩增出一大小为1131bp的cDNA片段,测序后分析序列推断该片段为编码肌动蛋白基因的完整阅读框cDNA,与SmAct2 cDNA序列同源性为92％。该其克隆到载体pET28a( )中,在大肠杆菌BL21中获得了较高量的表达,融合表达产物分子量约为43kDa。利用日本血吸虫成虫粗抗原免疫大白所得抗血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明所克隆的cDNA表达产物具有良好的抗原性。用该表达产物免疫昆明系小鼠,攻击血吸虫尾蚴以进行保护性实验。结果 其减虫率为28.4%,减卵率为29.2%,初步结果显示血吸虫肌动蛋白具有一定的免疫保护功能。     

日本血吸虫未知基因的获得、鉴定和编码区的克隆

目的：寻找日本血吸虫未知基因,并对其进行鉴定和编码区克隆。方法：运用表达序列标签（EST）法寻找日本血虫未知基因。对获得的表达序列标签运用生物学软件进行分析,根据同源基因序列推测其可能的功能,并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,结果：获得1个完整的日本血吸虫cDNA序列（JAYL0230）,氨基酸同源性分析发现与其他生物的抗凋亡因子1具有同源性,构建了重组克隆pEGFP-N3-JAYL0230,结论：FST法是一种快速发现和鉴定日本血吸虫未知表达基因的有效方法,有助于加速其全长cDNA的克隆。     

日本血吸虫TEGT基因的cDNA克隆和生物信息学分析

目的克隆日本血吸虫新基因TEGT(Sj.TEGT)的全长序列。方法根据编码日本血吸虫大陆株的EST基因片段的序列,设计5’RACE的系列引物,扩增Sj.TEGT的5’端,测序后预测该基因的全长ORF;再以此设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到Sj.TEGT的全长cDNA。结果从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA中克隆到1个TEGT相关基因,命名为Sj.TEGT基因。其编码的蛋白的分子质量大约为30ku;对其编码的氨基酸序列的分析显示其编码蛋白有6个跨膜螺旋区。结论Sj.TEGT是一个新基因,有必要对其功能进行深入研究。     

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果本研究获得了一个编码日本血吸虫Argo-naute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Real-time PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫泛素活化酶E1基因的克隆、表达及鉴定

目的扩增并表达日本血吸虫泛素活化酶E1蛋白。方法利用PCR技术得到E1基因序列,并将其克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹(Western blot-ting)分析表达产物与鉴定其免疫反应性。结果SjE1基因开放阅读框长651bp,编码217个氨基酸残基,Western blotting分析结果表明,纯化的SjE1蛋白能被疫区居民血吸虫抗体阳性者血清、急性及慢性及晚期血吸虫病患者血清识别,与健康人血清无反应。结论日本血吸虫蛋白基因SjE1在体外获得表达,其表达蛋白具有一定的抗原性。     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。     

日本血吸虫新基因SjF1的克隆、表达及免疫保护效果研究

目的 构建日本血吸虫中国大陆株SjF1原核表达重组质粒,并进行免疫保护效果测定。方法 用聚合酶链反应(PCR)法将SjF1基因从已剪切阳性克隆中扩增出来,克隆入原核表达载体pTWIN1上intein2的N端,经PCR和限制性酶切筛选阳性重组子。将阳性重组子转化大肠杆菌,在低温和低IPTG浓度下诱导表达可溶性重组融合蛋白。经鉴定后分别以FCA作佐剂经皮下免疫和以壳聚糖作佐剂经黏膜免疫昆明鼠,观察诱导产生的减虫和减卵效果。感染前采血和唾液用ELISA法检测抗体。结果 成功克隆并表达了rSjF1。rSjF1以FCA作佐剂经皮下免疫获得了29.92％的减虫率和51.08％的减卵率;rSjF1以壳聚糖作佐剂经滴鼻免疫获得了25.74％的减虫率和44.04％的减卵率。结论 获得了rSjF1,该蛋白以FCA作佐剂经皮下免疫和以壳聚糖作佐剂经黏膜免疫均能诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。