抗HBeAg单克隆抗体重链可变区基因的PCR法克隆和测序

本文应用ＰＣＲ技术从ＨＢｅＡｇ单克隆抗体鼠─鼠杂交瘤细胞基因组ＤＮＡ中扩增出重链可变区基因（ＶＨ）,并将ＶＨ基因与ｐＵＣ１９载体连接,转化ＪＭ１０９菌,克隆出ＶＨ基因。重组质粒ｐＵＣ－ＨＢｅＡｇＶＨ经荧光核酸测序表明,该ＶＨ基因大小为３２７ｂｐ,编码１０９个氨基酸。     

抗2型登革病毒特异性免疫球蛋白重链可变区基因的扩增与纯化

提取抗２型登革病毒单克隆抗体杂交瘤细胞ｍＲＮＡ和ＤＮＡ反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＰＣＲ扩增并纯化特异性免疫球蛋白重链可变区（ＶＨ）基因。琼脂糖凝胶和聚丙烯胺凝胶电泳观察结果;该ＶＨ基因约４５０ｂｐ。实验证明,上述两种方法均是分离和扩增ＶＨ基因的有效方法,但提取ＤＮＡ后进行ＰＣＲ较提取ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ经济,简单。     

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因重排研究

目的探讨不同胎龄新生儿免疫球蛋白（Ig）重链可变区（VH）基因重排情况。方法排除宫内感染的新生儿,其中胎龄27周4例,28～32周9例、33～36周12例、37～42周13例,提取其外周血RNA、进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增其IgVH基因、6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色。结果各个胎龄VH1-VH7各家族均有多个重排条带表达,同一个VH家族重排基因的平均中分子量在各个胎龄组间差异无显著性。结论27～42周新生儿IgVH基因VH1～VH7家族重排均具有多样性;对同一个V。家族来说,28～42周各胎龄组IgVH基因重排无显著性差异。     

用聚合酶链反应制备抗端粒酶蛋白重链和轻链可变区基因

目的：为了制备抗端粒酶蛋白hTERT可变区基因,方法：采用Ni-NTA树脂层析法从PBKTRT转染的E-coli JM109阳性菌中分离纯化端粒酶蛋白hTERT,并免疫小鼠,从免疫的小鼠脾脏中提取淋巴细胞中总RNA,逆转录成cDNA,以逆转录合成的cDNA第一条链为模板,分别用VH和VL引物,通过PCR进行,结果：PCR扩增反应产生350bp大小的抗hTERT重链和轻链可变区基因,VH和VL基因片段的获得为进一步制备抗hTERT单功能区抗体（dABs)和单链抗体ScFv奠定了实验基础。结论：提示该方法具有稳定性好,易于重复,扩增后VH和VL量较高的优点。     

利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因

目的:利用噬菌体表面展示技术制备抗人DR5单链抗体.方法:从抗DR5杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv基因.将scFv与PAK100载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌XL1-Blue,经VSCM13辅助噬菌体拯救,构建成鼠抗人DR5单链抗体库...     

人抗甲肝噬菌体抗体重链可变区基因的序列分析

目的：对人抗甲肝病毒噬菌体抗体阳性克隆５９７和６４６，进行重链ＤＮＡ序列分析，方法：用Ｓａｎｇｅｒ末端终止测定序列，计算机软件进行分析。结果：经同源性分析，这两个克隆的同源基因均来源于人免疫球蛋白重链基因序列，氨基酸序列推导可知，克隆６４６重链Ｆｄ基因和克隆５９７重链可变区基因均为单一开放读框，各编码２２５个氨基酸和１１９个氨基酸，２株克隆重链可变区含有明确的四个框架区和３个抗原决定互补区，结论：     

抗人精浆蛋白单克隆抗体轻,重链可变区基因的克隆及序列分析

获得鼠抗人精浆蛋白单抗可变区基因，为单链抗体的构建及表达奠定基础。方法；从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ，经反转录，ＰＣＸＲ分离获得了γ－Ｓｍ－ＭｃＡｂ轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆入ｐＵＣ１９质粒中，用全自动荧光ＤＮＡ序列分析仪对ＶＨ，ＶＬ基因序列进行了分析。     

抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达

目的：扩增出抗前列腺特异抗原（PSA）单克隆抗体（MAb)的重链可变区（VH）单域抗体基因,并在大肠杆菌中表达。方法从分泌抗PSAmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT－PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达。结果VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码,将其克隆到pGEX-4T-1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在,经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗PSA VH单域抗体,竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺要和活性。结论构建成功抗PSA的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

抗人黑色素瘤单抗重链可变区基因的克隆和序列测定

我们已报道了抗人黑色素瘤单克隆抗体Leo Mel3的轻链可变区基因序列。作者现报道该抗体重链可变区基因的克隆和序列分析结果。1 材料和方法 同文献[1]。2 结果 PCR之后进行琼脂糖凝胶电泳,见扩增     

抗HSV—糖蛋白（gp30）单克隆抗体重键可变区基因的克隆及序列分析

获得鼠抗ＨＳＶ－２型特异性糖蛋白单抗重链可变区基因，为基因工程改建及表达奠定基础。从分泌高中和活性的鼠抗ＨＳＶ－２型特异性单抗杂交瘤细胞系中提取ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，用ＰＣＲ法扩增出抗体重链可变区基因，并克隆入质粒，随机挑选阳性克隆进行核酸序分析。     

鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达

目的:扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV-PT)mAb轻、重链可变区(VL,VH)基因,构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达.方法:从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因,克隆到pGEM-T Easy载体,测序并对其结构进行分析.选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH的PBV220原核表达载体,42℃诱导表达,Western blot鉴定表达产物.结果:经测序证实,所克隆的VL基因为363 bp,VH基因为375 bp,两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%.构建了鼠抗HBV-PT抗体基因VL及VH的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应.结论:抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.     

鼠源性抗人成骨肉瘤抗体轻链基因克隆及其结构分析

目的 扩增与人成骨肉瘤细胞特异结合的鼠源性单克隆抗体轻链基因。并对其基因序列进行分析。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法从分泌鼠源抗入成骨肉瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞（７Ｆ６Ｂ）扩增出抗体轻链基因,克隆ｐＧＥＭ－Ｔ载体,以全自动测序仪测定其轻链基因序列并对其结构进行分析。结果 ７Ｆ６Ｂ轻链基因由６５６ｂｐ组成,编码２１８个氨基酸,序列分析证实该基因可变区序列符合小鼠Ｉｇ轻链基因的氨基酸序列特征。结论 区得的鼠     

PCR扩增抗乙酰胆碱受体单克隆抗体重链可变区基因的反应条件

应用多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增抗乙酰胆碱受体单抗重链可变区的基因，探讨了ＰＣＲ的反应条件和影响因素。     

抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因的克隆与鉴定

目的 克隆抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区（VH）基因.方法 从分泌抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2的杂交瘤细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,挑取菌落PCR鉴定后测序并进行分析.测序正确的质粒经EcoRI和XhoI酶切、纯化后的产物和原核表达载体pRSET A在SolutionI作用下连接,转化BL21（DE3）对重组质粒进行表达.经Tricine-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重链可变区表达产物的表达水平,用ELISA检测表达产物能否与日本脑炎病毒结合.结果 确定了2F2VH基因序列,长度为354 bp,编码118个氨基酸,第22位和第96位残基是维持抗体结构的半胱氨酸,含有特异性CDR1、CDR2和CDR3区域,符合鼠源性免疫球蛋白基因的特征.ELISA检测结果显示原核表达的2F2重链可变区产物可与日本脑炎病毒特异性结合.结论 获得了抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因.     

抗人精浆蛋白单抗重链Fd段基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的：获得鼠抗人精浆蛋白mAb重链Fd段基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法：从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,用RT-PCR法获取重链Fd段cDNA，将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色方法检测重链Fd段的表达。结果：从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆出了重链Fd段基因，序列测定表明,VH与鼠免疫球蛋白MUSIGHAEI同源性最高。将含重链Fd段基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7Fd中转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了重链Fd段的表达。结论：获得了序列正确的重链Fd段基因，它在HeLa细胞中可以成功地表达，为进一步构建和表达Fab奠定基础。     

胰腺癌单克隆抗体重链可变区基因的扩增

目的 从分泌抗体的胰腺癌杂交瘤ＹＰＣ３细胞扩增单抗重链可变区基因。方法 以一步法提取杂交瘤细胞ＲＮＡ，通过逆转录及聚合酶链式反应，反应产物以琼脂糖凝胶电泳观察。结果 扩增的基因长度为３５０ｂｐ，对照骨髓瘤细胞ＳＰ２／０未见扩增。结论该基因的成功扩增将为胰腺癌基因工程抗体的制备奠定了基础。     

乙酰胆碱受体单克隆抗体重链可变区PCR产物克隆的条件

聚合酶链反应扩增的乙酰胆碱受体单克隆抗体重链可变区基因经ＥｃｏＲ１和ＢａｍＨ１双酶切割后，与载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ连接，并经转化大肠杆菌ＤＨ５α而扩增，扩增后的重组质粒经酶切证实含有乙酰胆碱受体抗体的基因。为核苷酸序列分析准备了材料。     

肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的：获取抗人原发性肝癌单克隆抗体重、轻链可变区基因。方法：从分泌高亲和力的抗人原发性肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株ＳＭ８．１１中提取细胞的总ＲＮＡ，以随机引物反转录合成ｃＤＮＡ，以特异引物进行ＰＣＲ，扩增了单抗的重链可变区（ＶＨ）及轻链可变区（ＶＬ）基因，并进行了序列分析。结果：ＶＨ基因片段长度为３５１ｂｐ，编码１１７个氨基酸残基；ＶＬ基因片段长度为３２４ｂｐ，编码１０７个氨基酸残基。两者均有４个     

抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因(VL)，并构建其原核表达载体。方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA，通过RT-PER扩增出VL cDNA。用HindⅢ和Xho Ⅰ酶切纯化的RT-PER产物和原核表达载体pET28a( )，在LDNA连接酶作用下室温连接，重组质粒经酶切鉴定，阳性克隆测序并进行序列分析。结果 扩增出VL cDNA片段，大小约为340bp，重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VL基因序列长度为324bp，编码108个氨基酸。VL基因属于鼠免疫球蛋白κ轻链Ⅳ亚类。结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因．并成功构建其原核表达载体。