外源性FHIT基因表达对长春新碱诱导人胃癌MKN-28细胞凋亡的影响

目的:探讨外源性FHIT基因表达对长春新碱诱导的胃癌细胞凋亡的影响及其分子机制.方法:通过脂质体将重组FHIT基因PRC/CMV质粒和空载体转染到人胃癌细胞MKN-28,Western blot法检测外源性FHIT蛋白的表达;使用不同浓度的长春新碱分别处理各组细胞,MTT法分析细胞增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡:Western blot法检测细胞Bcl-2和Bax的表达.结果:转染FHIT基因后,MKN-28细胞检测到FHIT蛋白的表达;长春新碱处理48 h后,转染FHIT基因组细胞、转染空载体组细胞及未转染组细胞的凋亡率分别是30.967%±2.122%、11.033%±1.724%、10.733%±1.021%,转染FHIT基因组细胞凋亡更明显(F=142.045,P<0.05);转染FHIT基因组细胞经长春新碱处理后Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加.结论:外源性FHIT基因表达可以增强长春新碱诱导的胃癌细胞凋亡,其机制可能与凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达有关.     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响.方法 采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响.结果结果 GCRG213正向和反向克隆正确插人真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率.结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素.     

HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法:用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3/HBx瞬时转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3的细胞为对照.RT-PCR法检测HBx基因的表达;MTT法检测各组细胞的增殖活性;TUNEL法检测各组的凋亡情况.β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-xL、c-myc的表达量变化.结果:pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.HepG2细胞转染HBx基因后,相对于对照组细胞增殖能力明显下降,凋亡增多,差异有显著性意义(P＜0.01);转染HBx的细胞Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:成功将HBx基因转染入HepG2细胞,并在细胞中表达,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA表达,促进HepG2细胞凋亡,抑制增殖.     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤细胞MG-63增殖的影响及机制

目的探讨反义c-myc寡核苷酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响及机制。方法采用反义核酸技术设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞,MTT法及流式细胞仪法检测瘤细胞体外增殖、细胞周期及c-myc基因蛋白表达情况。结果MTT法示人骨肉瘤MG-63细胞的增殖受抑,10．0μmol／L、作用48h效果最明显;流式细胞仪示反义c—myc寡核苷酸主要阻止人骨肉瘤MG-63细胞进入S期,c-myc基因蛋白表达受抑。结论反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖;其机制为在基因水平干扰c-myc基因蛋白的表达。推测用反义策略抑制癌基因表达,或用基因敲除、基因替换的方法去除癌基因,可达到基因治疗的目的。     

c-myc反义寡核苷酸对结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

目的:研究体外c-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法:利用脂质体LipofectamineTM2000介导将c-myc ASODN转染入大肠癌HT-29细胞中, 逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、Westernblot方法检测c-myc基因mRNA及蛋白的表达,MTT、流式细胞仪(FCM)检测c-myc ASODN对人结肠癌HT-29细胞增殖抑制及其对奥沙利铂敏感性影响.结果:转染c-myc ASODN后, HT-29细胞内c-myc mRNA水平显著降低(0.464±0.029 vs0.974±0.027, 0.945±0.012, 均P<0.01). 在HT-29细胞中存在分子质量62 kDa的特异性条带, 与c-myc分子质量相符, ASODN组在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组; MTT结果显示转染c-myc ASODN 48 h后的HT-29细胞的增殖速度较对照组细胞明显减慢. FCM显示c-myc ASODN转染后72 h后, 奥沙利铂+ c-myc ASODN组细胞凋亡率显著高于对照组( P<0.05).结论:体外c-myc ASODN可抑制c-myc mRNA及蛋白的表达, 阻断c-myc可抑制HT-29细胞增殖并增强其对奥沙利铂的敏感性, 可能为大肠癌的基因治疗提供新的靶点.     

沉默miR-345联合5-FU对胃癌MGC803细胞增殖能力及凋亡的影响

目的 观察沉默miR-345联合5-FU对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803以沉默miR-345表达。应用40μg/ml 5-FU单独处理胃癌细胞MGC803或联合miR-345沉默组,克隆形成实验观察细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果 脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803可以抑制miR-345的表达;细胞克隆形成实验显示,反义miR-345+5-FU联合组与单独5-FU处理组相比,克隆形成率[(4.29±0.83)%vs(7.68±0.34)%]显著降低(P0.01);流式细胞凋亡检测表明,反义miR-345+5-FU联合组细胞凋亡率显著高于反义miR-345组、5-FU组(P0.01)。结论 沉默miR-345联合5-FU能抑制5-FU对MGC803细胞增殖能力,并促进其凋亡。     

PEBP1基因对胃癌细胞生物学特性影响的体外实验研究

目的探讨PEBP1基因对于胃癌细胞增殖状态、细胞周期、凋亡状态等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法将PEBP1基因插入载体pcDNA3.1构建PC-PEBP1真核表达载体。脂质体转染胃癌细胞系MKN45建立稳定转染细胞系(MKN-PEBP1),而后使用生长曲线法、平板克隆形成实验法、流式细胞仪、细胞迁徙实验法等分析稳定表达株相关生物学特性变化。同时设立pcDNA3.1空载体转染组(MKN-PC)和空白MKN45细胞组(MKN45)为对照。结果与MKN-PC组和MKN45组相比,转染MKN-PEBP1载体的稳定表达细胞株生长显著减慢,MKN-PC组和MKN45组之间无显著差异,平板克隆形成实验结果显示,MKN-PEBP1转染组平均克隆形成率显著低于MKN-PC组和MKN45组(P<0.05),细胞周期检测显示MKN-PEBP1组处于G0/G1期的细胞比例显著高于未处理的MKN45组细胞和MKN-PC组细胞(P<0.05),而处于G2-M期的细胞比例显著均低于其他两组(P<0.05),其他各期细胞比例均无显著差异。流式细胞仪法检测细胞凋亡结果显示各组细胞的凋亡比例均为2.0%左右,统计学检验无显...     

胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．方法:从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性内切酶KpnI,BamHI和EcoRI, BamHI识别位点．按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )．测序正确的重组子pcDNA3．1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3．1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用半定量RT-PCR及Wlestern blot比较转染不同质粒的 MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异．结果:经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体 pcDNA3．1( ),组成重组子pcDNA3．1-a(含正向克隆),pcDNA3．1-b(含反向克隆)．重组子 pcDNA3．1-a,pcDNA3．1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株．与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示转染pcDNA3．1-a的 MKN45细胞中其mRNA的表达上调35．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其mRNA 的表达下调32．1％;Western blot结果显示转染 pcDNA3．1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50．3％．结论:成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．     

脂质体介导的VEGF-C反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系 A549生长、凋亡的影响

目的 探讨脂质体介导的血管内皮生长因子C(VEGF-C) 反义寡核苷酸对肺腺癌细胞系 A549生长、凋亡的作用.方法 将 A549 细胞随机分为磷酸盐缓冲液对照组(PBS组)、正义寡核苷酸对照组(SODN组)和反义寡核苷酸转染组(AODN组),应用细胞计数方法计数每组细胞数,苏木精-伊红(HE)染色法观察细胞形态及分布,流式细胞仪分析A549细胞凋亡情况.应用Western印迹方法检测转染后各组A549细胞中VEGF-C蛋白表达.结果 VEGF-C反义寡核苷酸转染后,AODN组细胞生长受抑程度显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),生长缓慢且核分裂像较对照组明显减少.流式细胞仪检测结果显示AODN组细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).Western印迹结果显示VEGF-C反义寡核苷酸可明显抑制VEGF-C基因表达.结论 脂质体介导的VEGF-C反义寡核苷酸能有效地干扰VEGF-C基因表达,并可抑制肺腺癌A549细胞生长并促进其凋亡.     

pEGFP-C1-反义生存素重组质粒的构建和转染

目的 构建pEGFP-C1-反义生存素（survivin)重组质粒，并转染入人MKN-45低分化胃腺癌细胞株，观察转染前后生存素基因的表达及对凋亡的影响。从基因水平探讨反义生存素核酸治疗胃癌的分子生物学机制。为今后利用反义基因治疗肿瘤提供实验和理论依据。方法 应用基因重组技术构建 pEGFP-C1-反义生存素重组质粒，通过脂质体转染法转染人MKN-45胃腺癌细胞株，以流式细胞仪方法检测细胞凋亡，以RT-PCR技术检测质粒转染前后生存素基因mRNA的表达。结果 pEGFP-C1-反义生存素重组质粒转染MKN-45低分化胃腺癌细胞株后细胞凋亡明显增加，G2/M期细胞减少，同时生存素基因在mRNA水平被抑制。结论 反义生存素核酸能抑制细胞增殖。减少生存素基因的mRNA表达而促进胃癌细胞凋亡。