HRSV A2株细胞低温传代适应减毒指标的初步探索

[目的]分析人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)经人二倍体KMB17细胞低温传代后培养特性的改变.[方法]将HRSV A2株病毒接种到人二倍体KMB17细胞进行低温培养传代,将不同代次的病毒经鼻腔接种豚鼠,于d 7、d 14分别取肺组织作病理切片检查、分离血清进行中和抗体检测,同时测定不同代次病毒的一步生长曲线及温度敏感性特征.[结果]豚鼠经鼻腔接种,接种原代病毒组d 14处死时体重明显较对照组轻,低温第6代组和11代组与对照组接近,3组病毒均引发豚鼠间质性肺炎.低温第6代组和11代组与原代病毒相比,一步生长曲线未发生明显改变,增殖高峰约为9-12 d.[结论]HRSV经鼻腔接种豚鼠能引起强烈的肺部感染,豚鼠可作为HRSV毒力评价的动物模型;HRSV在KMB17细胞上经低温传11代,未出现明显的减毒株特征,还需要进一步减毒.     

汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选

目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代。比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Veto细胞灭活疫苗。研究疫苗的免疫原性。结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7．00～7．75LgCCID50／ml和1：3201：1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6．50～7．50LgCID50／ml和1：160～1：768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株Z34与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1：10。结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。     

细胞内快速连续传代培养甲肝病毒的研究

目的:研究甲肝病毒在细胞内快速连续传代培养病毒增殖情况,探索疫苗生产工艺改进的可能性。方法:将甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后形成带毒细胞,每7 d传代1次,检测每次收获物的甲肝病毒抗原(HAAg)滴度及感染性滴度,比较滴度的变化,同时检测一步生长曲线,分析病毒增殖特性有无变化。结果:甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后每7 d传代1次,其第1~8代抗原滴度为1 024~2 048 Eu/0.1 ml,感染性滴度为7.33~7.67 lg CCID50/ml,第9代开始下降,抗原滴度仅为256 Eu/0.1 ml,感染性滴度为6.83~7.00 lg CCID50/ml;在连续传10代内,细胞均未出现CPE现象;第10代与第1代相比,其一步生长曲线病毒增殖高峰均为20~25 d,没有明显变化。结论:甲肝病毒吕8株在KMB17细胞上每7 d传代1次,在第8代以内,其抗原滴度及感染性滴度均能达到较高的程度。经细胞内连续快速传代后,HAV吕8株生长的增殖高峰约为第20~25 d,与传代前样品没有明显差别。     

肾综合征出血热疫苗后备毒株的分离和生物学特性研究

目的从肾综合征出血热(HFRS)疫区阳性鼠肺中分离汉坦病毒(HV),并对分离到的病毒进行型别鉴定和生物学特性研究,为HFRS疫苗后备毒种库的建立打下基础。方法疫区阳性鼠肺研磨液接种长爪沙鼠分离病毒,并将分离到的HV经乳沙鼠脑内连续传代,采用直接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验,检查毒株的型别,研究传代后毒株的繁殖特性、病毒滴度和抗原滴度。结果从疫区32份阳性鼠肺中分离到9株HV,经单克隆直接荧光血清检查6株为汉滩病毒株,3株为汉城病毒株,经乳沙鼠脑内连续传代,其中4株毒株的病毒滴度和抗原滴度较高,汉滩和汉城毒株的病毒和抗原滴度最高分别达106.50、106.00和1∶5120、1∶5120。结论4株毒株的病毒滴度和抗原滴度均较高,可作为HFRS疫苗后备毒种的筛选毒株。     

登革4型病毒Ban18-30减毒株的生物学特性研究

目的将登革4型病毒(DEN_4)Ban18原株及其减毒株Ban18_30株在vero细胞传代后进行生物学特性比较研究,以了解Ban18_30株的毒力和免疫原性及其是否为一株有希望的DEN_4减毒活疫苗候选株。方法Ban18原株及在原代地鼠肾细胞传代减毒的Ban18_30株在vero细胞中增殖,将两毒株进行中和实验,确证两株的型别,研究传代毒株的病毒滴度、毒力和免疫原性。结果两株病毒与抗DEN_4特异性抗体进行中和实验,中和指数≥316,证明两株病毒确为DEN_4;空斑滴定两株病毒,滴度约为2×106~2.5×106PFU/ml;Ban18_30株对乳鼠的脑内毒力较Ban18原株低,≥1.7logLD50;Ban18_30株对幼鼠脑内接种不致病,而原株的logLD50值为4.3;腹腔免疫小鼠后用原株进行脑内攻击,能够抵抗大于1 000 LD50致死剂量的病毒攻击。结论两株病毒在vero细胞内增殖良好,滴度较高,Ban18_30对乳鼠和幼鼠的致病力明显减弱,在减毒的过程中仍保留了较高的免疫原性,有望成为一株DEN_4的减毒活疫苗候选株。     

从延边地区患病的家兔中分离出肾综合征出血热病毒

[目的]证明家兔对肾综合征出血热（HFRS）病毒具有敏感性。[方法]取病兔的肺，肾，肝脏，常规制备悬液，接种于小白鼠乳鼠脑腔，经2次传代见出现特异症状或死亡的乳鼠，常规方法分离病毒，并对其中3株系统鉴定，用间接免疫荧光（IFAT）试验检测分离病毒株的抗原特性。[结果]与分离病毒株的IFAT试验结果。病兔恢复期血清滴度≥4倍增长，正常人，非HFRS病人血清与呼肠弧病毒Ⅰ-Ⅲ型血清不发生反应。分离病毒株与HFRS病人血清，HFRS病毒单克隆抗体均为阳性反应。[结论]从家兔分离出的JR1，JR2和JR3株病毒是汉坦型HFRS病毒。     

在豚鼠体内霍乱弧菌凝集性的复原(摘要)

作者应用10株不同来源(病人、弧菌带菌者、水和乳)的不凝集弧菌,以豚鼠肺内传代的方法研究返祖为凝集型的可能性,结果;有4株经过2～8次传代,凝集了霍乱O血清,滴度达1:1600～1:3200,这些返祖菌株的毒力与作为对照的霍乱弧菌没有区别。有5株在豚鼠传代9～50代仍无凝集性,但它们的毒力明显提高了。只有1株在     

流行性肾病病毒在长爪沙鼠体内的增殖

本文报道用在北欧斯堪的纳维亚地区分离的流行性出血热病毒人工感染长爪沙鼠乳鼠获得成功。将已在欧洲棕背(鼠平)体内适应的流行性肾病(NE)病毒 H(?)lln(?)s 株,脑内接种5天龄的长爪沙鼠乳鼠,从第七天起,利用两步的免疫荧光抑制法,即可在其肺、脾、肝、胰、脑、脊髓及小肠中找到病毒相关抗原,并至少持续49天。这些抗原在脏器中的分布与 NE 病毒的自然宿主欧洲棕背(鼠平)类似。NE 病毒可在乳鼠体内连续传代,第一代即有33%乳鼠受染,到第3代以后乳鼠感染率均为100%,感染度随代数逐渐增强,其第3代及第5代接种后28天的肺悬液 ID50     

从延边地区患病的家兔中分离出肾综合征出血热病毒

[目的 ]证明家兔对肾综合征出血热 (HFRS)病毒具有敏感性。 [方法 ]取病兔的肺、肾、肝脏 ,常规制备悬液 ,接种于小白鼠乳鼠脑腔 ,经 3次传代见出现特异症状或死亡的乳鼠 ,常规方法分离病毒 ,并对其中 3株系统鉴定 ,用间接免疫荧光 (IFAT)试验检测分离病毒株的抗原特性。 [结果 ]与分离病毒株的IFAT试验结果 ,病兔恢复期血清滴度≥ 4倍增长 ,正常人、非HFRS病人血清与呼肠弧病毒Ⅰ～Ⅲ型血清不发生反应。分离病毒株与HFRS病人血清、HFRS病毒单克隆抗体均为阳性反应。 [结论 ]从家兔分离出的JR1 、JR2 和JR3 株病毒是汉坦型HFRS病毒     

HFRS病毒血凝素在Vero-E_6细胞培养和新生乳鼠脑组织中产生的动态观察

对肾综合征出血热病毒(HFRSV)感染后的Vero-E_6细胞和新生乳鼠脑组织中病毒血凝素(HAN)产生的动态观察结果,发现:(1)病毒感染后第3d可在细胞内外检出病毒HAN,并分别在第9d和第7d达到高峰;(2)感染细胞内病毒HAN滴度明显高于其培养上清,而细胞内外感染性病毒颗粒和病毒抗原的含量差别则不明显;(3)在感染乳鼠脑组织中第2d即可检出病毒抗原和活病毒,第5d检出病毒HAN。病毒HAN的产生与其毒力呈正相关。     

3株肾综合征出血热病毒的分离和鉴定

目的了解浙江省肾综合征出血热（HFRS）流行特点及汉坦病毒（HV）型别，为防治提供科学依据。方法鼠肺HV抗原检测采用直接免疫荧光法（DFA），病毒分离采用阳性鼠肺研磨液接种幼龄长爪沙鼠，再经vero-E6细胞传代，用单克隆抗体DFA定毒株及分型。结果从捕自浙江省龙泉地区的8份阳性鼠肺中分离到3株HV，经DFA鉴定均为汉滩型（Ⅰ型）病毒，3株病毒在Vero-E6细胞中的感染滴度为10^4.75～10^5.25CCID50／ml。结论从鼠类肺组织中分离到3株汉滩型HV，毒株均能在Vero-E6细胞中较好增殖，有可能成为HFRS疫苗后备毒株。     

Analysis of the accumulation of mutants in Sabin attenuated polio vaccine viruses passaged in Vero cells

To confirm the safety of oral poliomyelitis vaccine (OPV) cultured in Vero cells, the genetic stability of cultured polio vaccine viruses was analysed by MAPREC (mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage). The rates of mutant accumulation of the viruses passaged in Vero cells under a low multiplicity of infection (MOI) condition (approximately 10(-3.5)CCID50/cell; the same as under usual OPV production conditions) were higher than those passaged in secondary cultured monkey kidney cells. However, the rates of mutant accumulation were restrained when the viruses were cultured under a high MOI condition (approximately 10(-1.5)CCID50/cell) in Vero cells. Furthermore, neurovirulence of the passaged viruses in pollovirus susceptible transgenic mice PVR-Tg21 was shown to correlate highly with the results of MAPREC. It is expected that our results will contribute to the large scale preparation of safe and effective OPV using Vero cells.     

HAV吕8株生长特性及残余活毒检测方法的研究

[目的]对甲型肝炎病毒吕8株(HAV吕8)培养生长特性进行研究,确定其灭活后残余活毒检测方法的可靠性。[方法]通过一步生长曲线确定HAV吕8株的生长增殖高峰;将活病毒样品作2倍系列稀释后接种于细胞,研究不同接种量的最早检出时间;以统计学方法计算细胞培养方法检测HAV的灵敏性及可靠性;以病毒在细胞上的感染性为指标,经3次传代检测其有无感染性,以确证灭活疫苗残余活毒检测方法的可靠性。[结果]HAV吕8株细胞培养增殖高峰约为d20￣24;细胞培养方法检测甲肝病毒的灵敏性可达1.79CCID50、可靠检出甲肝病毒的最低量为10.23CCID50;凡达到ELISA的检出灵敏度的HAV接种样品,当培养增殖到d12时,均能被检出;当HAV含量达到512Eu/0.1ml时,不论是活病毒还是已灭活病毒,其吸附在细胞上的残余病毒量均能达到ELISA的检测灵敏度。[结论]将甲肝灭活疫苗样品接种细胞进行残余活毒检测,经3次传代,每次培养20d以上,该检测方法有较高的灵敏度,其检测结果是可靠的。     

水痘减毒活疫苗的质量控制及稳定性研究

水痘减毒活疫苗的质量控制及稳定性研究 ,是确保疫苗安全有效的重要组成部分。将Oka水痘病毒株接种于MRC 5人二倍体细胞 ,制成冻干水痘疫苗并进行检测。结果显示 :该疫苗主要技术指标 (病毒滴度、残余水分等 )均符合世界卫生组织规程要求 ,具有良好的免疫效果 ,同时稳定性试验取得令人满意的结果。表明该水痘疫苗是安全有效的     

2009甲型流感病毒BJ501介导小鼠肺炎模型的建立

目的建立2009甲型H1N1流感毒株BJ501介导小鼠的肺炎动物模型,并与鼠肺适应流感PR8毒株进行比较,为研究流感的致病性、宿主的适应性及抗流感病毒药物筛选提供实验基础。方法 6~8周的BALB/c雌性小鼠216只随机分为3组,每组72只,鼻腔分别接种相同体积的甲型流感病毒BJ501、甲型流感病毒PR8(阳性对照)和PBS溶液(阴性对照)后,每隔12 h观察小鼠整体反应并测量体质量,在感染第1、3、5、7、9、11、13天分批宰杀,取肺组织检测肺指数并进行病理观察。结果 BJ501组和PR8组的整体反应、体质量变化、病理变化、肺指数变化符合甲型流感病毒感染肺炎的基本特征,其中PR8组第3-8天体质量显著低于PBS组(P0.05),而BJ501组体质量在接毒后第7天才显著低于PBS组(P0.05),BJ501组在第3天、第4天体质量显著高于PR8组(P0.05);肺指数情况:BJ501组和PR8组分别在第9天和第7天达到峰值(1.88±0.43),(2.73±0.71),BJ501组在第3-7天明显低于PR8组(P0.05);病理结果表明,接种病毒组小鼠肺脏出现不同程度的病理改变,PR8组炎症重于BJ501组。结论成功建立2009甲型流感病毒BJ501介导的小鼠肺炎模型,并发现BJ501毒株对肺脏的炎性损伤程度要比PR8毒株略轻。     

滨蒿内酯抑制组胺诱导的哮喘豚鼠气道平滑肌细胞内钙释放

目的研究滨蒿内酯（scoparone,Sco）剂量依赖性舒张气管平滑肌及降低气道高反应性的可能作用靶点及途径,为进一步将其开发成为平喘的中药新药提供药理学理论依据。方法建立卵蛋白诱导的哮喘豚鼠模型,通过离体豚鼠气管环的舒缩实验及应用倒置荧光显微成像系统测定培养的ASMCs[Ca2＋]i浓度的方法,分析Sco预先给药及直接作用对ASMCs[Ca2＋]i的影响。结果显示无论细胞外含钙或无钙,组胺具有收缩ASM环及升高培养的ASMC[Ca2＋]i作用,哮喘组明显高于对照组（P〈0.05）,预先给予Sco组与对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;在细胞外无钙时10-4M Sco直接作用培养的ASMCs,可明显抑制各浓度组胺诱导的ASMCs[Ca2＋]i的上升（P〈0.05）。结论预先给予Sco及直接作用都可不同程度改善哮喘豚鼠ASMCs对不同浓度组胺的高反应性,这可能与Sco抑制哮喘豚鼠ASMCs IP3介导的内钙释放途径有关。     

利用Labworks凝胶成像分析系统判断甲肝减毒活疫苗RT-PCR滴度

目的利用Labworks凝胶成像分析系统判断甲肝减毒活疫苗RT-PCR滴度,并比较此方法与常规组织培养法的相关性.方法通过对RT-PCR反应液的离子浓度、pH值等条件进行优化,建立了检测甲肝减毒活疫苗滴度的RT-PCR一步法;利用Labworks凝胶成像分析系统的半定量功能判断结果,并与常规组织培养法比较.结果利用Labworks凝胶成像分析系统判断结果的RT-PCR一步法与常规组织培养法检测甲肝减毒活疫苗滴度灵敏度相仿,检测结果无显著差异.结论此法与常规RT-PCR法相比具有更简便,判断标准更客观的优点,可代替组织培养法检测甲肝减毒活疫苗滴度.     

草血竭纯化部分对小鼠甲型H1N1流感的疗效

目的探讨草血竭纯化部分对于小鼠甲型H1N1流感的疗效。方法采用滴鼻法建立甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型,通过灌胃途径给予不同剂量的草血竭,以给予奥司他韦者为阳性对照,以未给予药物者为病毒对照组。观察14d内小鼠生活状态,计算小鼠肺指数,检测肺组织内流感病毒核酸相对量和病毒滴度。结果甲型H1N1流感病毒对小鼠的半数致死量为10-6。阳性对照组和草血竭高、中剂量组小鼠的存活率均为100%,平均生存日数均为14d,草血竭低剂量组小鼠的存活率为42.86%,平均生存日数为9.14d,而病毒对照组小鼠的存活率及平均生存日数分别为0和3.57d。不同组别小鼠平均生存日数比较,差异有统计学意义(F=8.53,P=0.02);阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠平均生存日数均高于病毒对照组(P0.05)。阳性对照组和草血竭高剂量、中剂量、低剂量组及病毒对照组肺指数分别为:(0.84±0.07)%、(0.81±0.07)%、(0.84±0.10)%、(0.84±0.10)%和(1.42±0.12)%,差异有统计学意义(P=0.03);病毒核酸相对量分别为:0.37±0.11、0.42±0.06、0.42±0.06、0.65±0.19和1.00±0.06,差异有统计学意义(P=0.04);病毒滴度分别为:2.49±0.12、2.35±0.29、2.43±0.15、2.46±0.12和2.80±0.16,差异有统计学意义(P=0.04)。阳性对照组和草血竭各剂量组的肺指数、肺组织内流感病毒核酸相对量和病毒滴度均低于病毒对照组(P0.05);而阳性对照组的上述指标与草血竭各剂量组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论草血竭纯化部分在体内对甲型H1N1流感病毒具有抑制作用,能够改善甲型H1N1流感小鼠的肺组织的病变,降低病死率。     

Intranasal immunization with HRSV prefusion F protein and CpG adjuvant elicits robust protective effects in mice

Human respiratory syncytial virus (HRSV) is a leading cause of lower respiratory tract infections in elderly individuals and young children/infants and can cause bronchiolitis and even death. There is no licensed HRSV vaccine. An ideal vaccine should induce high titers of neutralizing antibodies and a Th1-biased immune response. In this study, we used EXPI293 cells to express the fusion (F) protein with a prefusion conformation (PrF) and compared the safety and efficacy of intranasal immunization with PrF in combination with two mucosal adjuvants (CpG ODN and liposomes) in mice. After two intranasal administrations, mice in the PrF + CpG group produced high titers of neutralizing antibodies (4961) and a Th1-biased immune response compared with the PrF + Lipo group. The lung viral load of mice in the PrF + CpG group was significantly reduced (3.5 log) compared with that in the adjuvant control group, and the survival rate was 100 %, while the survival rate of mice in the PrF + Lipo group was only 67 %. At the same time, this immunization strategy reduced the pathological damage to the lungs in mice. In conclusion, the combination of PrF and CpG adjuvant is immunogenic, elicits a Th1 type immune response, and completely protects mice from a lethal HRSV challenge. It is worthy of further evaluation as an HRSV vaccine in clinical trials.Clinical trial registration.This study was not related to human participation or experimentation.     

Genotype circulation pattern of human respiratory syncytial virus in Iran

In order to have information on the molecular epidemiology and genetic circulation pattern of human respiratory syncytial virus (HRSV) in Iran, we studied the genetic variability of both group A and B HRSV strains during seven consecutive years by sequencing the hypervariable C-terminal domain of G protein. A total of 485 children <2 years of age who were negative for influenza viruses, screened for the presence of HRSV in this research. HRSV was detected in 94 (19.38%) of the samples using nested RT-PCR. Group A viruses were isolated during each year, while group B viruses were isolated during 2009 and 2013. Phylogenetic analysis showed that all HRSV group A viruses belonged to three genotypes: GA1, GA2, GA5 and the group B viruses were in BA genotype.