流感病毒型别及亚型的多重RT-PCR方法快速检测

目的为适应流感疫情监测中快速诊断的需要,建立敏感特异的流感病毒多重逆转录PCR(MRTPCR)检测方法。方法对甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型流感病毒的血凝素(HA)基因保守区域分别设计引物进行MRTPCR。另设计了两对引物对H1N1和H3N2亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)N1、N2作亚型判断。结果MRTPCR可特异性检测出各型流感病毒的目的片段,相互间无交叉反应。二次PCR反应后对H1N1、H3N2流感病毒的检测灵敏度可达0.10TCID50/50μl以下,对乙型流感病毒的检测灵敏度可达0.01TCID50/50μl以下。应用此方法也可特异性地检测出H1N1和H3N2流感病毒的NA基因。结论用MRTPCR从临床患者含漱液标本中检出相关流感病毒的灵敏度要高于用狗肾传代细胞(MDCK)或鸡胚分离的灵敏度,达到了快速、敏感、正确检测流感病毒及其亚型的目的。     

双重荧光定量RT—PCR在快速检测A、B型流感病毒上的应用

目的 建立双重荧光定量RT-PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒,并应用于临床样本的检测.方法 在A型流感病毒M基因和B型流感病毒HA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感含漱液标本检测.结果 该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.1TCID50和0.01TCID50,具有较好的稳定性.可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法.     

多重RT-PCR结合反向杂交技术检测多种流感病毒方法的研究

目的 建立一种基于多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的多种流感病毒核酸快速检测方法.方法 对5种亚型流感病毒的HA基因序列进行比对分析,选择合适的保守区域设计引物序列,并在扩增产物序列内部选择高变区设计探针序列.首先,使用生物素标记的引物扩增出同样带标记的PCR产物;然后,产物与膜上的探针杂交,通过生物素-亲和素反应,最后以斑点显色的方式来检测和鉴别不同亚型的流感病毒.实验中还通过摸索不同的引物浓度和探针浓度来优化反应条件.结果 成功建立了一种基于多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的检测方法,该方法能够成功检测和鉴别5种不同亚型的流感病毒,检测灵敏度比传统的RT-PCR方法高100～1000倍.结论 成功建立了一种可高通量快速检测多种流感病毒的多重RT-PCR结合反向斑点杂交技术的检测方法.     

Kadipiro病毒TaqmanReal—timePCR检测方法的建立

目的利用TaqManReal—timePCR技术,建立Kadipiro病毒（KDV）实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank发表的KDV基因序列资料分析结果,在其第12片段基因区段设计KDV特异引物与探针,利用14株不同科属病毒核酸验证方法特异性,重复实验检验方法稳定性,利用体外转录的定量RNA标准品建立基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针具有良好的特异性,同一样品重复检测D值的变异系数均〈1．8％,定量分析模型的灵敏度为100拷贝／反应。结论建立了一种特异、灵敏、高效的KDV一步法TaqManReal-timePCR检测方法,为今后该病毒的监测与研究工作提供技术手段。     

Banna病毒TaqMan探针法RT-PCR检测方法的建立

目的 建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法。方法 首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计。病毒在BHK21细胞或C6／36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录。以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测，并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价。结果 Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性，可以检出所有12株Banna病毒，而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、bated病毒和环状病毒检测结果均为阴性。与传统PCR相比，敏感性高100倍以上，可以检出每50止标本中含有0.5CCID50的Banna病毒。单链RNA变性条件（65℃）进行逆转录使检测结果的敏感性比99℃变性法最少低10倍。病毒在室温保存1天和4℃保存1周后，检出敏感性会比原来低10倍左右。该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时，均显示出较好的特异性。112份蚊标本中检出6份标本阳性，4份可疑阳性，病毒分离结果3份阳性。结论 本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法，并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测，为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段。     

扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒的核酸检测方法,以期用于埃博拉出血热临床标本的检测.方法 针对扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因设计引物和探针,建立单重和双重实时荧光RT-PCR检测方法,利用体外转录病毒RNA和埃博拉病毒系列参考品RNA评价其敏感性,利用马尔堡病毒、健康人、登革热患者和发热伴血小板减少综合征患者血清评价其特异性.结果 所建立的实时荧光RT-PCR检测方法扩增效率在95％～105％,可特异性地检测扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因,与马尔堡病毒、登革热和发热伴血小板减少综合征病毒均无交叉反应,体外转录的病毒RNA可检出10～100拷贝/μl.双重检测方法通过细胞培养的扎伊尔型埃博拉病毒RNA验证,可检出100 pfu/ml病毒.结论 本研究建立的检测扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于埃博拉出血热临床标本的检测.     

LNA探针同时检测人副流感病毒1,2,3型多重荧光定量RT-PCR方法的建立

目的 人副流感病毒1,2,3型是呼吸道感染的主要病原.本研究建立了特异、快速、灵敏的多重荧光定量RT-PCR方法用于人副流感1,2,3型病毒临床标本检测.方法 针对人副流感1,2,3型病毒设计特异性引物探针,优化荧光RT-PCR反应条件.应用体外转录方法分别制备人副流感1,2,3型病毒的标准品.验证荧光定量RT-PCR方法的特异性,敏感性和稳定性.结果 该方法对人副流感1,2,3型病毒核酸检测有高度特异性,检测的灵敏度HPIV1为10个拷贝,HPIV2为100个拷贝,HPIV3为100个拷贝.可从临床患者鼻咽吸出物标本中直接检出.结论 本研究建立的LNA探针同时检测人副流感病毒1,2,3型多重荧光定量RT-PCR方法具有较高的特异性和敏感性.适用于临床早期诊断和实验室病原谱筛查.     

流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制

目的 获得基因工程抗流感病毒抗体,为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基因。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,Oligo-dT逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A／Sydeny/5/97(H3N2）为固相抗原筛选抗体Fab段,并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果 分离到两株Fab克隆,IV－2和IV－6,流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性,间接免疫荧光实验呈阳性,它们都具有血浆抑制作用,病毒中和实验显示能使病毒滴度下降30倍和20倍。结论 获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体,为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。     

辽宁省甲3亚型流感病毒HAl基因特性分析

目的 了解2001-2006年间辽宁省甲3亚型流感病毒HAl基因变异特征.方法 采用辽宁省流感监测的咽拭分离株,对其中的7株甲3病毒核酸提取,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物测序,推导出其氨基酸序列,并用DNA MAN软件包中的Alignment做了差异和同源性比较,用Mega软件包中的Neighbor Joining方法 ,通过与NCBI数据库中2000-2006年28株H3N2流感病毒同源比对后,制作种系进化树,进行基因进化特征分析.结果 序列分析发现,甲3亚型流感病毒与WHO当年的疫苗株M/California/7/2004比较,在其HA1核酸序列上有12处碱基不同,4个氨基酸位点发生了替换.基因及氨基酸序列同源性下降.与WHO北半球疫苗株A/Wisconsirn/67/2005序列更接近,但仍有4处碱基不同.结论 甲3亚型流感病毒基因序列发生了变异,与甲3亚型疫苗株A/California/7/2004同源性有下降趋势,提示其抗原可能发生部分漂移或更换,与南方浙江2005年株、WHO北半球2006-2007疫苗株A/Wiseonsin/6712005序列接近,提示南方春夏季流感流行株极有可能在北方秋冬季流行,对流感流行病学监测,疫苗株使用指导都具有重要意义.     

多重RT-PCR方法检测甲型流感病毒

目的建立一种快速、敏感、特异的多重RT-PCR,同时检测甲型流感病毒中的3个分型:甲型H1N1流感病毒,季节性H1N1流感病毒,季节性H3N2流感病毒,并将此方法应用到实验室流感病毒核酸检测技术中。方法利用甲型流感病毒3个分型病毒的引物,在同一个RT-PCR反应体系中,对疑似流感咽拭子标本进行检测。结果多重RT-PCR对甲型流感病毒中分型病毒有较高的灵敏度和特异性,可直接从疑似流感标本中同时进行甲型流感病毒分型检测。结论此实验中采用的多重RT-PCR具有与常规RT-PCR一样的特异性和敏感度,而且比普通RT-PCR和病毒分离法更快速,也更简便。     

产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对O1群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。 方法根据O1群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因rfb-O1和霍乱肠毒素的A亚基编码基因ctxA的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用便携式Smartcycler Ⅱ实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性。 结果实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌的检测敏感度为1．0×10^2拷贝每反应体系;对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1．0×10^1 pg每反应体系;该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2h内完成。 结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力。     

A simple and rapid technique to process formalin-fixed,paraffin-embedded tissues for the detection of viruses by the polymerase chain reaction

Summary The use of chelating resin in a simple, rapid and efficient pre-treatment protocol to process formalin-fixed, paraffin-embedded specimens for the polymerase chain reaction (PCR) is described and compared to other pre-treatment techniques. With this modified PCR protocol, a variety of human autopsy and biopsy specimens were investigated for presence of DNA of human papil-lomaviruses, cytomegalovirus or Epstein-Barr virus. These viruses were detected in a productive or non-/low-productive state. Amplimers generated ranged from 88 to 450 base pairs length. Under the specified technical conditions, a considerable range of DNA molecules can be amplified from paraffin-embedded material, some older than 10 years.Dedicated to Prof. Dr. G. Seifert to his 70^th birthday.     

广西HIV-1重组毒株env区快速基因分型方法的建立

目的建立一种快速简便的基因分型方法，对广西HIV-1重组毒株env基因区进行亚型鉴定。方法从HIV阳性样品中提取核酸，使用HIV-1M组通用引物对env区进行第一轮扩增，第二轮则使用分别检测B′/C或C亚型和CRF01-AE亚型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同来判断亚型。将通用引物扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果50份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本3份（6％），CRF01-AE样本43份（86％），4份（8％）样本无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测得出B′/C或C亚型样本3份（100％），CRF01-AE样本39份（90．7％），灵敏度为91．3％，特异度为100％。两种方法检测结果经差异性检验显示X^2=2．25，P〉0.05，差异无统计学意义，结果一致者占92％。与基因分析结果吻合。重复实验显示CRF08-BC平均重复性为100％（10／10），CRF01．AE为93．8％（61／65）。结论该方法是一种简便、快速、低成本，具有高度灵敏性和特异性的HIV-1毒株env基因区分型法，能够直接对广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株进行鉴定。     

A hemi-nested PCR assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid

This paper is the first to describe the development of a hemi-nested PCR assay for the detection of vesicular stomatitis virus (VSV) nucleic acid. This assay was developed as it combines high sensitivity for virus genome detection with the identification of the external amplification product in the reamplification step, thus confirming the specificity of the reaction. The assay did not depend on the presence of infectious virus in samples, as demonstrated by its detection of VSV in blood samples which were non-infectious in tissue culture. One further advantage was that the VSV-New Jersey and VSV-Indiana serotypes could be differentiated through the selective use of the appropriate hemi-nested primer. This assay is ideal for the study of VSV pathogenesis and persistence.     

多重PCR检测方法和液态芯片技术在呼吸道病毒检测中的应用研究

目的 评估澳大利亚维多利亚感染性疾病参比实验室（The Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory,VIDRL）的呼吸道病毒多重PCR检测方法和Luminex公司多指标同步分析液态芯片技术-呼吸道病毒检测试剂盒（xTAG RVP）,应用于多种常见呼吸道病毒检测的优势和缺点,为更好地、有针对性地选择合适技术进行临床实验诊断或公共卫生应急检测提供依据.方法 使用VIDRL的呼吸道病毒多重PCR检测方法和Luminex公司xTAG RVP试剂盒对198份临床流感样症状患者的咽拭子标本进行常见呼吸道病毒的核酸检测.结果 198份临床标本经VIDRL多重PCR方法和xTAG RVP方法检测,阳性率分别为38.89％和45.45％,符合率为72.22％.单一病毒的符合率为87.88％～100％.结论 xTAG RVP方法与VIDRL多重PCR方法相比,两者在常见呼吸道病毒检测中的特异性和敏感性相近,xTAG RVP方法具有明显的快速和高通量的优势.     

马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速、敏感、特异的双重实时荧光定量PCR方法,可同时检测马尔堡病毒和埃博拉病毒.方法 通过序列比对挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列,分别设计引物及Taqman探针,两条探针分别标记FAM和Texas Red荧光报告基因,建立双重实时荧光定量PCR反应体系.结果 双重荧光定量PCR方法检测两种病毒阳性标准品的灵敏度分别为30.5拷贝/μl和28.6拷贝/μl,通过检测日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应,有较好的灵敏度和特异性.结论 建立了马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法,实现了两种病毒同时实时定量检测,在传染病防控领域有较好的应用前景.     

16SrRNA基因在快速诊断新生儿败血症的病原菌研究

目的探讨血液16SrRNA基因检测在新生儿败血症诊断中的应用价值。方法分析细菌16SrRNA基因保守区,设计一对通用引物扩增已知实验菌株,检测其特异性,用倍比稀释法检测其敏感性,同时进行血培养。结果已知实验菌株均获得920bp扩增产物,对照组中的人类基因组DNA、HBV—DNA和白色假丝酵母菌无相应产物。敏感性测试能达到lpg大肠杆菌DNA。PCR阳性率为31．7％（20／63）,血培养阳性率为14．3％（9／63）,两者比较有显著性差异（P〈0.05）。结论PCR检测血液细菌16SrRNA基因,具有特异性强,敏感度高等特点,能在临床推广应用。