普罗布考抑制bFGF和H2O2引起的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖

目的： 研究普罗布考抑制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和H2O2促大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMCs）增殖的机制。方法: 采用MTT、［³H］-TdR掺入法、流式细胞术和RT-PCR观察普罗布考对bFGF和H₂O₂刺激条件下细胞周期、细胞增殖和凋亡的影响。结果: ①普罗布考抑制bFGF和H₂O₂刺激RASMCs增殖。细胞计数、A值和［³H］-TdR掺入量分别下降了40.0%、39.1%、45.5%和46.9%、45.0%、39.5%（P<0.05，P<0.01）。②普罗布考使RASMCs生长停滞在G₀/G₁期，抑制bFGF刺激的细胞增殖，通过诱导细胞凋亡和抑制细胞生长2种方式抑制H₂O₂刺激的细胞增殖。③bFGF和H₂O₂分别使ERK1mRNA表达量增加近4倍和6倍，MKP-1mRNA表达量下降了62.4%和82.2%。普罗布考抑制ERK1mRNA表达，使H₂O₂诱导的MKP-1表达下降上调，而对bFGF诱导MKP-1表达下降无明显影响。结论: 普罗布考通过降低ERK1mRNA表达抑制细胞周期运转和诱导RASMCs凋亡，从而抑制bFGF和H₂O₂刺激引起的细胞增殖。     

β3整合素在生长因子促血管平滑肌细胞粘附和迁移中的作用

目的:探讨血小板衍生生长因子(PDGF)对β₃整合素表达的影响及β₃整合素在PDGF促血管平滑肌细胞(VSMC)粘附、迁移和增殖中的作用。方法:用抗β₃整合素胞外域抗体封闭VSMCβ₃整合素后,通过-TdR掺入、细胞粘附、细胞迁移分析及RT-PCR等方法,检测PDGF对β₃整合素表达及对VSMC粘附、迁移和增殖的影响。结果:阻断β₃整合素与细胞外基质(ECM)蛋白相互作用后,可在一定程度上抑制PDGF刺激的VSMC增殖,使-TdR掺入率降低39%;在β₃整合素抗体浓度为10mg/L时,PDGF引发的细胞粘附和迁移受到显著抑制(P＜0.05);PDGF作用于VSMC6h,β₃整合素基因表达活性达到峰值,比对照细胞高87%。结论:PDGF可显著诱导β₃整合素在VSMC中表达;β₃整合素与ECM蛋白相互作用在PDGF促VSMC粘附、迁移方面发挥重要作用。     

硫化氢对培养的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨硫化氢(H₂S)对内皮素-1(ET-1)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导途径的作用。方法:体外培养雄性SD大鼠主动脉VSMC, 将细胞分成对照组、血清组、内皮素组、NaHS组、血清+NaHS组和内皮素+NaHS组进行研究, 以不同浓度梯度NaHS处理VSMC, 观察对VSMC[³H]-TdR掺入和MAPK活性的影响。结果:加入5×10^-5-5×10^-4mol/LNaHS可明显浓度依赖性地抑制由内皮素诱导的VSMC增殖, 其[³H]-TdR掺入量减低, 抑制率分别为16.8%-37.4%(P＜0.01), 其MAPK活性明显减低, 抑制率为7.4%-33.6%(P＜0.05或P＜0.01)。结论:H₂S对内皮素诱导的VSMC增殖有抑制作用, 同时使MAPK活性下调。推测H₂S对VSMC增殖的抑制效应可能由MAPK信号途径所介导。     

过氧化氢对血管平滑肌细胞增殖和明胶酶A及其抑制因子基因表达的影响

目的:探讨过氧化氢(H₂O₂)对体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和明胶酶A(MMP-2)、及其抑制因子(TIMP-2)基因表达的影响。方法:先用四甲基偶氮唑(MTT)法筛选出H₂O₂对VSMC的毒性作用浓度和增殖作用浓度,在此基础上用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定H₂O₂对MMP-2、TIMP-2mRNA表达的影响。结果:H₂O₂浓度大于300μmol/L后显示出对VSMC的致死毒性作用;H₂O₂浓度在0.01-5.0μmol/L内可以刺激VSMC的增殖,且呈时间依赖性;1μmol/LH₂O₂、10μmol/LH₂O₂对MMP-2基因转录有明显的促进作用;不同浓度的H₂O₂对TIMP-2基因转录无明显促进作用。结论:适当浓度的H₂O₂可以促进VSMC的增殖和MMP-2mRNA表达,但对TIMP-2mRNA表达无明显作用,提示H₂O₂参与了血管重塑的不同病理环节。     

Canstatin RNA转染对兔血管平滑肌细胞体外增殖的抑制作用

目的:探讨canstatin对体外培养的兔血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法:将阳离子脂质体介导的canstatinRNA转染VSMC,应用细胞计数,[³H]-TdR掺入率测定观察canstatin基因对VSMC增殖的作用。结果:阳离子脂质体介导的canstatinRNA可有效地转染VSMC并能显著地抑制VSMC的增殖及其DNA的合成率。结论:Canstatin基因可抑制体外培养的VSMC的增殖.     

血小板源生长因子可促进低氧的牛肺动脉平滑肌细胞核内NF-κB表达

目的:为探讨血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)受体信号转导途径的介质分子之一过氧化氢( H₂O₂ )在低氧的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC )增殖中是否起作用。方法:应用共聚焦显微镜、细胞免疫组织化学及Western印迹杂交等方法,检测了低氧的PASMC PDGF受体途径中的H₂O₂的变化及PDGF和H₂O₂对细胞核内与增殖作用相关的核转录因子NF-κB表达量的影响。 结果:PDGF可使常氧的PASMC中H₂O₂浓度增高,但明显降低低氧的PASMC中H₂O₂的量;同一浓度的H₂O₂,作用于常氧的PASMC,则引起核NF-κB的表达量增加,但对低氧的PASMC核NF-κB有明显的抑制作用;同时加入PDGF和H₂O₂的低氧的PASMC较仅以H₂O₂作用的低氧的PASMC,核NF-κB的量显著增加。结论:PDGF受体的信号转导途径在低氧的PASMC同常氧的PASMC相反,H₂O₂为抑制因子,对细胞可能产生损伤作用,PDGF可抑制低氧的PASMC产生H₂O₂并达到促进NF-κB表达增强的目的,从而使胞内与增殖相关的基因表达增强,最终达到低氧条件下表达增强的PDGF对低氧性PASMC过度增殖的正反馈调节作用。     

红景天甙对低氧培养的兔肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究红景天甙(Salidroside,Sal)对低氧(3%)条件下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞内钙离子浓度的影响。方法:应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入试验、Fluo-3和激光扫描共聚焦显微术测定细胞内Ca²⁺浓度等方法。结果:低氧24h可直接刺激PASMC,使MTT的A值增加62%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量增加138%(P＜0.01)。在低氧的PASMC培养液中加入Sal(32×10^-5mol/L)可抑制低氧的这种促增殖作用,与低氧组相比MTT的A值下降29%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降37%。在低氧的PASMC培养液中加入钙通道阻滞剂verapamil也可抑制低氧的促增殖作用,与低氧组相比较,MTT的A值下降23%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降51%(P＜0.01)。PASMC的低氧培养可使细胞内Ca²⁺浓度明显增加(P＜0.05),Sal可抑制低氧所致的细胞内Ca²⁺浓度的上升。结论:红景天甙可抑制低氧促进PASMC增殖、DNA合成的作用,其机制可能与抑制低氧时细胞内Ca²⁺浓度增加有关。     

金属硫蛋白抑制同型半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的:研究金属硫蛋白(MT)对同型半胱氨酸(Hcy)诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖的影响及其作用机制。方法:以[³H]-TdR掺入法测定VSMCs增殖程度,免疫沉淀法测定VSMCs内丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性,[¹⁰⁹Cd]-血红蛋白饱和法测定MT含量,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,NADH氧化法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果:Hcy(10^-6-10^-4mmol/L)呈浓度依赖性的刺激培养大鼠VSMCs[³H]-TdR掺入,0.1mmol/LHcy刺激[³H]-TdR掺入比对照组高4.2倍(P＜0.01)。Hcy亦呈浓度依赖性地激活VSMCsMAPK活性、增加细胞MDA的生成和LDH的漏出(P均<0.01)。单独MT孵育,对VSMCs的上述指标均无明显影响(P＞0.05)。但MT(10^-6-10^-4mol/L)呈浓度依赖性抑制100μmol/LHcy的促增殖效应(r=0.98,P＜0.01)。MT显著抑制Hcy对VSMCs的MAPK活性、MDA生成和LDH漏出的激活作用(均P＜0.01)。以0.5mmol/LZnCl₂预孵育6h后,VSMCsMT含量比非诱导细胞高5.7倍(P＜0.01),这种内源性MT高表达的细胞,显著抵抗Hcy刺激的-TdR掺入和MAPK激活;抑制Hcy的促细胞MDA生成与LDH漏出效应(均P＜0.01)。结论:MT能有效抑制Hcy促大鼠VMSCs增殖作用,其机制可能与MT拮抗Hcy对MAPK的激活和其抗氧化作用有关。     

尾加压素Ⅱ促兔肺动脉平滑肌细胞增殖及机理探讨

目的:探讨尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ,U-Ⅱ)对兔肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的作用及机理。方法:采用植块法培养家兔PASMCs,以MTT测定和[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入法观察U-Ⅱ对PASMCs增殖的影响,加入不同浓度的几种细胞内信号转导阻断剂,观察对U-Ⅱ效应的影响。 结果:U-Ⅱ(10^-9 mol/L-10^-7 mol/L)浓度依赖地促进PASMCs的A值增加及 -TdR掺入,以10^-7 mol/L U-Ⅱ的作用最明显,A值和[³H]-TdR掺入量分别较对照组高42.9%和68.5%(P＜0.05) 。10^-10 mol/L U-Ⅱ对PASMCs增殖无作用。尼卡地平、W₇、H₇、PD₉₈₀₅₉在一定浓度范围内(10^-7 mol/L-10^-5 mol/L)均可以浓度依赖地抑制U-Ⅱ诱导的PASMCs的A值增加及[³H]-TdR掺入增加。在浓度为10^-5 mol/L时,其抑制作用最明显,A值的抑制率分别为42.3%、19.6%、23.2%和10.5%(P＜0.05), -TdR掺入量的抑制率分别为46.6%、9.8%、21.7%和14.7%(P＜0.05 )。 结论: U-Ⅱ具有较强的促PASMCs增殖的作用,其诱导PASMCs增殖是通过Ca²⁺、CaM、PKC、MAPK来介导的。     

肾上腺髓质素对尾加压素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:观察肾上腺髓质素(ADM)对尾加压素Ⅱ(UⅡ)刺激的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法:贴块法培养大鼠胸主动脉VSMC;[³H]-胸腺嘧啶([³H]-TdR)掺入测定反映VSMCDNA合成;[γ-³²P]-ATP标记的同位素法测定丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性。结果:UⅡ(10^-8mol/L)显著促进VSMC-TdR掺入和激活MAPK比对照组分别高38%(P＜0.05)和260%(P＜0.01)。UⅡ加10^-10、10^-9、10^-8mol/LADM组VSMC-TdR掺入分别较UⅡ组低7%(P＞0.05)、32%(P＜0.05)和41%(P＜0.01)。MAPK活性分别低24%(P＞0.05)、32%(P＜0.05)和36%(P＜0.05)。结论:肾上腺髓质素抑制UⅡ诱导的VSMC增殖,可能与其抑制MAPK活性有关。     

内皮细胞Jagged1下调促进PDGF诱导的大鼠平滑肌细胞增殖迁移

目的： 探讨内皮细胞Jagged1表达对PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖迁移的调节作用。方法: 分离培养大鼠主动脉内皮和平滑肌细胞,将内皮接种于下室、平滑肌接种于上室建立细胞共培养体系,根据内皮是否行Jagged1小RNA干扰分为对照组、空载体组和Jagged1小RNA干扰组。用Western blotting检测内皮细胞Jagged1的干扰效率。于下室加入PDGF（10 μg/L）干预24 h后分别用［3H］-TdR 掺入和平滑肌迁移计数检测平滑肌细胞增殖迁移能力,用Western blotting检测平滑肌细胞α-SM-actin蛋白表达。结果: 与对照组相比空载体组内皮细胞Jagged1蛋白表达无明显差异,Jagged1小RNA干扰组内皮细胞Jagged1蛋白吸光度相对值明显降低（0.26±0.02 vs 0.67±0.02, P<0.05）;PDGF+空载体组平滑肌［3H］-TdR 掺入量和迁移数与PDGF组相比无明显差异,PDGF+Jagged1小RNA干扰组平滑肌［3H］-TdR 掺入量和迁移数高于PDGF组{［3H］-TdR 掺入(23 074±2 702)counts·min-1·well-1 vs (16 442±1 803)counts·min-1·well-1,n=5,P<0.05;迁移(27±4)cells/field vs (15±3) cells/field, n=5,P<0.05};PDGF+空载体组平滑肌α-SM-actin蛋白表达与PDGF组相比无明显差异,PDGF+Jagged1小RNA干扰组平滑肌α-SM-actin吸光度相对值低于PDGF组（0.25±0.06 vs 0.49±0.04, n=3,P<0.05）。结论: 内皮细胞Jagged1下调促进PDGF诱导的平滑肌细胞增殖迁移,提示血管内皮细胞Jagged1表达在维持平滑肌收缩表型、抑制平滑肌过度增殖迁移中起一定调控作用。     

Ang-Ⅱ对大鼠胚心成纤维细胞的影响

目的：探讨血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)对大鼠胚心成纤维细胞(FB)的促增殖作用和促胶原蛋白合成作用及其机制。方法： 应用同位素掺入技术，检测Ang-Ⅱ对体外大鼠胚心FB的促增殖和促胶原蛋白合成作用，并应用放射自显影和荧光法，检测FB上的Ang-Ⅱ受体分布和细胞内游离Ca2+浓度。结果： Ang-Ⅱ使FB ［3H］TdR和［3H］脯氨酸的掺入率明显增加，放射自显影显示在细胞表面有大量银颗粒出现，图像分析显示膜上受体银颗粒在竞争抑制组明显少。细胞内游离Ca2+浓度较高。结论： Ang-Ⅱ有刺激大鼠胚心FB增殖和胶原蛋白合成作用， 大鼠心肌FB膜上有Ang-Ⅱ受体，受体磷酸化后 ，通过细胞内游离Ca2+浓度增加等一系列细胞内信号系统的活化，出现FB的增殖和胶原蛋白合成。     

内皮素受体阻断剂抑制磷酸甘油诱导血管平滑肌细胞钙化

目的：在离体钙化的血管平滑肌细胞上，观察内皮素受体阻断剂对血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响，探讨内皮素(ET)促进细胞钙化的信号转导和分子机制。方法：β-磷酸甘油制备钙化VSMCs；通过细胞钙含量,［45Ca2+］摄取，碱性磷酸酶活性测定，判断钙化程度，［3H］-胸腺嘧啶（［3H］-TdR）和［3H］-亮氨酸（［3H］-Leu）掺入测定细胞DNA合成，竞争性定量RT-PCR测定VSMCs骨桥蛋白 （OPN） mRNA水平，放射免疫法测定培养上清ET含量。结果: 与正常对照VSMCs相比，钙化VSMCs内钙含量，［45Ca2+］摄入及碱性磷酸酶活性分别增加 119%、174%和7倍（P<0.01），OPN表达增加86%；细胞生长活跃，［3H］-TdR和［3H］-Leu分别增加71%和35%；钙化细胞培养基中内皮素含量较对照组增加35%(P<0. 05)。而钙化加内皮素受体阻断剂BQ123组明显减轻VSMCs钙化程度，钙含量，［45Ca2+］摄入及碱性磷酸酶活性分别较钙化组降低33%、37%、40%（均P<0.01），OPN表达明显下调25%；细胞增殖活性明显降低。结论: BQ123可减轻VSMCs钙化程度，表明ET促进VSMCs钙化主要是通过内皮素A型受体（ET-A）途经。     

表皮生长因子对传代培养的大鼠生长板软骨细胞增殖与胶原合成的影响

目的：探讨不同浓度的表皮生长因子（EGF）对传代培养的大鼠肋生长板软骨细胞（RGC）增殖和胶原合成的影响。 方法： 分离、培养RGC，分别用Western blot和阿尔新蓝（Alcine blue）染色检测各代RGC中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达；用［³H］-TdR和［³H］-proline掺入分别检测1、10和100 μg/L EGF对第1、3和5代RGC增殖和胶原合成的影响。 结果： 原代培养的RGC表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖，从第4代起Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达迅速降低，RGC发生了去分化。［³H］-TdR掺入表明，EGF促进第1代RGC的增殖（P<0.01），3个浓度的作用依次为：1 μg/L>10 μg/L>100 μg/L，差异显著（P<0.01）；3个浓度的EGF对第3代RGC保持了相近的促增殖作用（P<0.01）；对第5代RGC均无促增殖作用(P>0.05)。与促增殖作用不同，不同浓度EGF促不同传代的RGC的［³H］-proline掺入率比对照组均高20%左右（P<0.01）。 结论： EGF具有促进培养RGC增殖和胶原合成的作用，连续传代引起的去分化降低了RGC对EGF促增殖作用的反应，但对EGF的促胶原合成作用没有产生影响。     

脱氧核酶抑制人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：观察增殖细胞核抗原（PCNA）基因特异性的10-23脱氧核酶（DNAzyme）对人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）增殖的影响。 方法： 设计合成针对PCNA基因起始密码AUG的DNAzyme，应用脂质体转染法将其转入体外培养的HUASMC。检测DNAzyme干预HUASMC 2 d后［3H］-TdR的掺入量；通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法分析HUASMC的增殖；采用流式细胞仪检测细胞周期。 结果： 1.0 μmol/L DNAzyme干预HUASMC 2 d后，［3H］-TdR的掺入量低于对照组（P<0.05）。1.0 μmol/L的DNAzyme和反义寡聚核苷酸（ASODN）组处理2、3和5 d后，MTT比色吸光度值低于对照组（均P<0.01）。DNAzyme对细胞增殖的抑制呈剂量依赖性。细胞干预2 d后，DNAzyme、ASODN和对照组的G0/G1期细胞的比率分别为73.8%、54.7%和41.1%。 结论： 针对PCNA的DNAzyme能有效抑制HUASMC的体外增殖。     

原花青素对同型半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响

目的： 探讨葡萄籽中的原花青素(GSP)对同型半胱氨酸(HCY)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移的抑制作用及其机制。方法: 采用细胞计数及［3H］-TdR检测细胞增殖，用DCFH-DA、Western blotting法检测GSP对VSMC增殖、迁移的抑制作用及分析其相关的分子信号转导通路。结果: HCY浓度依赖性地诱导VSMC的增殖与迁移, 1 mmol/L HCY使VSMC的增殖与迁移分别比对照组升高3.9倍及4.1倍(P<0.01)；DCFH-DA结果显示, 1 mmol/L HCY使VSMC的活性氧(ROS)水平比对照组升高4倍(P<0.01)。而在不同浓度的GSP(5-20 g/L) 处理组，HCY诱导VSMC的增殖、迁移以及活性氧水平都被显著抑制(P<0.01)。在GSP 20 g/L 处理组，VSMC的增殖、迁移以及活性氧水平都接近空白对照组。与HCY组相比，GSP还显著降低HCY诱导VSMC MCP-1、IL-6及TNF-α的表达水平(P<0.01)。GSP还阻断HCY诱导的NF-κB的激活及显著降低NF-κB的活性(P<0.01)。结论: GSP通过抑制NF-κB的激活而抑制HCY诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及炎症反应。