家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析

目的对家蝇幼虫天蚕素基因进行克隆和序列分析。方法根据Genbank公布的家蝇成虫天蚕素Cecropin基因序列设计一对引物，以家蝇幼虫cDNA库液为模板，PCR扩增该基因的编码区序列。结果家蝇幼虫天蚕素cDNA目的基因的长度为229bp，与成虫防御素基因一致性为96％；最大的ORF位于20bp～211bp，含192bp。编码63个氨基酸。结论初步预测了该基因编码蛋白的化学性质和二级结构，为该基因的重组表达研究打下基础。     

应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统高效表达家蝇天蚕素

目的应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统中高效表达家蝇天蚕素,研究伴侣分子对家蝇天蚕素基因在大肠杆菌中表达的影响。方法RT-PCR克隆家蝇的天蚕素成熟肽(mature cecropin,MC)与泛素(ubiquitin,UBI)基因,利用生物信息学方法分析硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)-MC和MC分子结构及Trx-MC分子和Trx-UBI-MC两种融合蛋白mRNA5'端的二级结构的异同。分别构建pET32a-MC和pET32a-UBI-MC两种重组质粒,转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中。检测Trx-MC融合蛋白的表达和pET32a-MC和pET32a-UBI-MC在相同诱导时间及诱导剂浓度的条件下,融合蛋白表达量的差异。结果生物信息学分析结果显示MC分子被Trx分子包裹在其内部,MC分子的细胞毒性被去除,使其可以在大肠杆菌中正常表达。分子生物学实验结果进一步验证了生物信息学分析结果的正确性。同时,也显示UBI分子的加入,未影响融合蛋白质Trx-UBI-MC与Trx-MC的mRNA5'端二级结构。并且Trx-UBI-MC融合蛋白在全菌蛋白中的含量明显高于Trx-MC。结论Trx作为伴侣...     

家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析

目的：克隆家蝇幼虫防御素（defensin）基因并进行序列分析。方法：根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物,以家蝇幼虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增、测序,并利用软件进行序列分析。结果：克隆得到的defensin基因的长度为330bp,编码92个氨基酸,4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同,为K或N。结论：从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因,发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白,并初步预测了两种前体蛋白的化学性质和二级结构,为该基因的重组表达奠定了基础。     

家蝇乙酰胆碱酯酶基因的克隆与序列分析

目的克隆家蝇Ace基因并进行表达,并对家蝇AChE序列进行分析,为利用基因工程进行酶改造提供必要的参考. 方法结合已有的文献资料,利用生物信息学方法对家蝇AChE的序列进行分析,包括密码子偏爱性、系统发生、三维结构预测等. 结果成功克隆家蝇Ace基因,并利用同源模建方法获得了家蝇AChE的三维结构,以果蝇AChE为参考,判断了家蝇AChE应属于AChE 2家族. 结论根据所得家蝇AChE的三维模型从理论上分析了因AChE中一个氨基酸突变导致家蝇产生有机磷抗性的可能原因,并为半理性改造家蝇乙酰胆碱酯酶提供了三维模型.     

家蝇黏蛋白mucin-46基因的序列分析

目的：分析和预测家蝇黏蛋白mucin-46基因及其编码蛋白的结构和特性.方法：利用EST测序技术从家蝇幼虫cDNA文库中获得家蝇黏蛋白mucin-46基因cDNA序列,采用美国国家生物技术信息中心（NCBI）、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（Expasy）中的相关工具,对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析.结果：家蝇黏蛋白mucin-46基因的cDNA序列具有完整的开放阅读框（ORF）,全长1 383 bp,编码460个氨基酸;其编码的蛋白质理论分子量为46.42 kDa,等电点4.13;无信号肽及跨膜区,属于亲水性蛋白,具有4个几丁质结合功能域,含有4个糖基化位点及多个蛋白磷酸化作用位点;二级结构β折叠（E）和无规则卷曲（L）的比例是14.13∶85.87,没有α螺旋（H）结构类型;主要分布于细胞核.结论：应用生物信息学方法从家蝇cDNA文库中筛选出了家蝇黏蛋白mucin-46基因序列并预测了其结构及功能等生物学信息,为进一步研究家蝇围食膜蛋白的功能奠定了一定的基础.     

大鼠β-防御素rBD-2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达

从大鼠皮肤提取总RNA, 以P1 5′→3′TTCAGTCATGAGGATCCATTAC和P2 5′→3′ GGTTCTTGGTCTTTTTATCTAC引物,采用RT-PCR技术扩增得到一cDNA片段,经核苷酸序列测定,并根据其推导的氨基酸序列与人β-防御素-2和大鼠β-防御素-1进行同源性比较,结果显示,该cDNA片段编码的氨基酸序列具高度同源性(其成熟肽与hBD-2的同一性为50%,相似性为32%),均含6个典型的半胱氨酸,这表明所克隆的cDNA为大鼠β-防御素-2亚类,因此命名为rBD-2.大鼠β-防御素-2基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人hBD-2的表达相似,能够被诱导表达.以上结果提示,β-防御素-2可能是皮肤组织对感染性损伤的防御反应所产生的重要免疫介质.     

人瘦素基因的原核表达载体构建及其蛋白结构分析

目的 克隆人源Leptin的成熟肽编码序列后基因并构建其原核重组表达菌株,对其产物进行纯化鉴定;生物信息学分析其蛋白质结构并预测功能.方法 提取人脂肪干细胞中的总RNA,经RT-PCR反转录获得cDNA序列,PCR扩增Leptin基因并将其克隆入表达载体pET-28a(+)原核质粒,构建该基因的重组原核表达载体pET-28a-Leptin.随后进行双酶切和测序鉴定.在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,通过WB检测Leptin蛋白的表达;利用在线网络生物信息学相关数据库和分析软件对测序结果进行分析,并对重组蛋白结构及功能等进行验证和预测.结果 PCR扩增得到Leptin目标DNA片段;成功构建重组表达质粒pET-28a-Leptin,经IPTG诱导表达后,目的蛋白在宿主E.coli BL21 (DE3)中高效表达Leptin融合蛋白,相对分子质量18000.生物信息学检索该基因编码蛋白的氨基酸序列与理化参数显示,蛋白无跨膜区,有6个Ser、1个Thr可能为蛋白激酶磷酸化位点,第1～21位可能为信号肽区域.在Leptin氨基酸序列中:α-螺旋93处,无规则卷曲43处,延伸链17处,β-转角14处,分别占总二级结构的55.69％、25.75％、10.18％和8.38％.结论 成功克隆了人的Leptin基因.利用原核载体表达系统成功表达并进一步纯化的Leptin蛋白具有免疫原性.其生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测结果可为深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鉴.     

华支睾吸虫Rab2基因的克隆表达及生物学特性分析

目的获得原核表达的华支睾吸虫Rab2蛋白,并探索其生物学特性。方法从华支睾吸虫cDNA文库获得CsRab2的全长cDNA,NCBI搜索与之相似度高的基因序列,预测其所含结构域和功能;应用Vector NTI程序对来自于Gen Bank中与之有较高相似度的基因序列进行分析,构建基因进化树;Swiss-model预测其三维立体结构,原核表达重组融合蛋白CsRab2,采用Western blot鉴定重组蛋白CsRab2,采用q RT-PCR测定CsRab2基因在不同发育阶段的表达水平。结果 CsRab2全长基因的ORF包含588个碱基,编码195个氨基酸。Prot Param预测该编码蛋白的理论分子量和等电点分别是22.29×103 Mr和5.87。不含有信号肽,也未发现线粒体等亚细胞定位序列,三维预测结果显示,Rab2同Rab家族的其他蛋白类似:由保守的G结构域和长度、序列上高度可变的N端和C端形成。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色观察该目的蛋白分子量约28×103 Mr。经过亲和层析方法纯化获得的rCsRab2,可被His tag小鼠单克隆抗体识别。CsRab2在华支睾吸虫各生活史阶段均有表达,且在囊蚴和尾蚴阶段表达较高。结论 CsRab2属于保守蛋白,其生物信息学分析符合Rab家族蛋白的共有特性,在囊蚴和尾蚴阶段表达较高,但CsRab2在细胞内确切的定位信息和功能仍有待进一步研究。     

HBVS-ecdCD40L融合基因构建及相应融合蛋白的二级结构预测

目的构建HBVS—ecdCD40L融合基因,并利用软件对其相应融合蛋白的二级结构进行预测。方法利用分子生物学技术将HBVS基因与人CD40L胞外段基因进行融合,构建融合基因及其真核表达载体,并利用蛋白质分析软件对相应融合蛋白二级结构水平的一些生物学特性进行预测。结果融合基因序列与设计一致,其相应氨基酸序列经软件分析,并与HBsAg和CD40L胞外段氨基酸序列分析结果比较,发现在二级结构上几乎无变化,亲水性和抗原性等生物学活性几乎未受影响。结论HBVS-ecdCD40L融合基因构建成功,软件分析表明融合过程未影响HBsAg和人CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究奠定基础。     

ATRA诱导上调基因RIG-C的cDNA克隆和序列分析及蛋白表达

目的 克隆和表达维甲酸诱导上调的新基因RIG-C。方法 运用Blast、pfam等生物信息学手段对RIG-C的全长cDNA序列进行结构与功能预测;将RIG-C全长阅读框架插入原核表达载体pET22b中,在JM109(DE3)菌株中进行诱导表达;将全长RIG-C插入真核表达的绿荧光蛋白载体pEGFP-Cl中,转染NIH3T3细胞以观察RIG-C的亚细胞定位。结果 RIG-C基因cDNA全长1266bp,编码421个氨基酸,N端具有多个WD40结构域,C端有一个SOCS家族典型结构。原核表达的RIG-C蛋白大小约45kd,NIH 3T3细胞表达的RIG-C定位于细胞浆。结论 克隆和表达了新基因RIG-C,为进一步研究其生物学功能和蛋白质的空间结构奠定了基础。     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

中药罗仙子抗动脉粥样硬化活性部位氨基酸HPLC指纹图谱分析

目的：构建中药罗仙子抗动脉粥样硬化活性部位氨基酸指纹图谱,为明确其氨基酸组成及建立其质量控制方法提供实验依据。方法用2,4-硝基氟苯柱前衍生法建立罗仙子抗动脉粥样硬化活性部位水解氨基酸的HPLC指纹图谱,优化衍生条件。结果衍生剂量为1%（体积分数）2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB ）乙腈溶液1.0 mL、衍生温度为60℃、衍生时间为60 min时,衍生化完全;样品水解氨基酸中谷氨酸和精氨酸的质量分数较高,均大于5%;HPLC指纹谱图共确定24个共有峰,10批样品相似度在0．99-1．00之间。结论本方法稳定、可靠,重复性好,明确了罗仙子抗动脉粥样硬化活性部位的氨基酸组成,并初步建立了该部位的质量控制方法。     

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的：克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法：提取家蝇幼虫总RNA，根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物，RT-PCR扩增目的基因片段，T-A克隆后测序，应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果：RT—PCR扩增出一条约310bp的目的片段，序列分析表明，其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97％，核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论：成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列，为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。     

抗菌肽Cecropin-His-6基因的真核表达及其生物活性研究

目的 研究家蝇幼虫Cecropin-His-6抗菌肽基因生物学功能。方法从家蝇幼虫体内扩增Cecropin-His-6抗菌肽基因，构建pcDNA3．1／Cecropin-His-6重组表达质粒并用脂质体转染CHO细胞中，G418筛选，HisTrap HP亲和层析柱纯化目的蛋白，琼脂糖平板抑菌试验检测目的蛋白的抗菌活性。结果pcDNA3．1／Cecropin-His-6重组质粒成功转染入CHO细胞中，并获得具有抗菌活性的Cecropin-His-6目的蛋白。结论家蝇幼虫抗菌肽哺乳动物型工程细胞表达系统的建立，为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

三种家蝇酚氧化酶基因表达差异研究

目的进行不同品系家蝇酚氧化酶基因表达量差异的分析研究。方法根据酚氧化酶基因序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在家蝇抗性品系、敏感品系、现场采集品系家蝇体内酚氧化酶的表达水平差异。结果酚氧化酶基因在抗性品系蝇体内的表达量是敏感品系的13.38倍,现场品系是敏感品系的6.24倍。结论家蝇酚氧化酶基因可作为新的抗性检测及治理基因靶标。     

家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对肿瘤细胞A375抑制作用的研究

目的:研究家蝇胚胎抗菌蛋白对肿瘤细胞A375生长的抑制作用。方法:利用脂多糖诱导家蝇胚胎细胞提取抗菌蛋白,将提取的抗菌蛋白用PBS配制成40、80、160、320及640μg/mL 5个浓度组,做黑色素瘤细胞A375的MTT实验,实验组采用等量PBS,观察家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对A375的抑制作用,以人脐静脉血管内皮细胞作为正常对照组。结果:MTT检测显示五种浓度抗菌蛋白对A375均有抑制作用,与阴性组相比P<0.05,差异有显著性。各浓度组对人脐静脉血管内皮细胞无抑制作用,与阴性组相比P>0.05,差异无显著性。结论:家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对肿瘤细胞A375具有明显抑制作用,而对正常人体细胞无抑制。     

家蝇幼虫血细胞的分类及感染后的形态变化

目的用不同方法观察家蝇三龄幼虫血细胞的分类、各类血细胞计数及感染大肠杆菌后血细胞的形态变化。方法(1)应用姬氏染色结合相差显微镜对家蝇三龄幼虫血细胞形态进行观察并分类。(2)倒置显微镜下观察家蝇三龄幼虫血细胞总数(THC),姬氏染色法计数各类血细胞(DHC)。(3)观察大肠杆菌感染后家蝇幼虫血细胞形态的变化。结果(1)家蝇三龄幼虫血细胞可分为原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞、类绛血胞5类。其中浆血胞又分为大核浆血胞和小核浆血胞两种。(2)家蝇三龄幼虫血细胞总数为7090±651/μl,其中原血胞约1.2%、浆血胞约50.4%、粒血胞11.4%、珠血胞约36.2%、类绛血胞约0.8%。(3)感染大肠杆菌后,浆血胞发生空泡、细胞变形等变化。结论家蝇三龄幼虫血细胞分为5类,血细胞总数为7090±651/μl,其中浆血胞是主干血细胞,并参与感染后的细胞免疫。