转人B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测

目的探讨转入B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测。方法采用脂质体介导法将已建好的真核表达质粒pEGFP-C1-B7-H3导入人鳞癌细胞Tca8113中（Tca8113/B7-H3）,RT-PCR检测B7-H3在该细胞中的表达,Western blot检测其蛋白的表达。经G418筛选后,用有限稀释法建立稳定高表达的带有B7-H3基因的Tca8113鳞癌细胞株。结果RT-PCR方法检测到目的基因B7-H3的一个215bp大小的cDNA扩增产物;DAB显色,裂解的Tca8113/B7-H3基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约65～86ku大小的特异性条带。转染B7-H3的Tca8113细胞,经过细胞传代培养后仍然能够检测到高表达的B7-H3基因,经过有限稀释法建立了Tca8113/B7-H3细胞株。结论成功建立了Tca8113/B7-H3细胞株,为以后的体内外试验提供了很好的平台,为近一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。     

转人4-1BBL-B7-H3基因口腔鳞癌细胞体外诱导抗肿瘤免疫的研究

目的通过构建转人4-1BBL-B7-H3基因肿瘤细胞株,探讨4-1BBL-B7-H3体外诱导抗肿瘤免疫的能力。方法通过脂质体法将真核表达载体pEGFP-4-1BBL-B7H3转染人口腔鳞癌Tca8113细胞,经G418筛选及有限稀释后获得稳定高表达克隆,用流式细胞仪分析表型,RT-PCR检测转染细胞中4-1BBL-B7-H3mRNA的表达。用淋巴细胞分离液分离纯化人外周血T淋巴细胞,分别与转染4-1BBL、B7-H3、4-1BBL-B7-H3的Tca8113细胞混合培养。用CCK-8法检测细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性;ELISA法检测培养上清液中IFN-γ水平。结果转基因Tca8113细胞能够稳定高表达4-1BBL-B7-H3。与Tca8113细胞相比较,转染4-1BBL-B7-H3的Tca8113细胞能够显著增强T细胞增殖,促进IFN-γ分泌,并有效地诱导CTL产生对Tca8113细胞的特异性杀伤作用。结论转染人4-1BBL-B7-H3基因既能增强口腔鳞癌Tca8113细胞的免疫原性,亦能诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答。     

诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在舌癌细胞株中的表达

 【目的】探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血管内皮生长因子（VEGF）在舌鳞癌细胞株Tca8113中的表达,为进一步研究iNOS和VEGF在舌鳞癌肿瘤血管生成中的作用提供实验基础。【方法】采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和SP免疫组化方法,对舌鳞癌细胞株Tca8113中iNOS和VEGF mRNA和蛋白表达情况进行检测。【结果】RT-PCR检测到舌鳞癌Tca8113细胞株中iNOS／VEGF mRNA条带明显,SP免疫组化检测到iNOS／VEGF蛋白在舌癌细胞胞浆中呈强阳性表达。【结论】iNOS／VEGF mRNA和蛋白在舌鳞癌Tca8113细胞株中呈高水平表达。     

诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在舌癌细胞株中的表达

【目的】探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血管内皮生长因子（VEGF）在舌鳞癌细胞株Tca8113中的表达,为进一步研究iNOS和VEGF在舌鳞癌肿瘤血管生成中的作用提供实验基础。【方法】采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和SP免疫组化方法,对舌鳞癌细胞株Tca8113中iNOS和VEGF mRNA和蛋白表达情况进行检测。【结果】RT-PCR检测到舌鳞癌Tca8113细胞株中iNOS／VEGF mRNA条带明显,SP免疫组化检测到iNOS／VEGF蛋白在舌癌细胞胞浆中呈强阳性表达。【结论】iNOS／VEGF mRNA和蛋白在舌鳞癌Tca8113细胞株中呈高水平表达。     

VES诱导口腔鳞癌Tca8113细胞凋亡的实验研究

目的 明确VES对口腔鳞癌细胞Tca8113的作用,为临床应用VES防治口腔鳞癌提供科学的实验数据.方法 RT-PCR法检测促凋亡基因bax在Mrna水平上的表达,Western blot检测促凋亡基因bax在蛋白水平上的表达.结果 bax基因在Mrna水平上及蛋白水平上表达上调.结论 VES诱导口腔鳞癌细胞Tca8113的凋亡作用,bax基因可能参与该过程.     

人舌鳞状细胞癌耐放疗细胞系的构建及多药耐药基因和蛋白的表达

目的:建立人舌鳞状细胞癌耐放疗细胞系并检测多药耐药基因和蛋白的表达.方法:利用人舌鳞癌细胞株Tca8113, 采用单次剂量1 Gy,每周2次的60Co照射,诱导其耐放疗性,建立一株耐放疗的人舌鳞癌细胞系.并用免疫组化以及RT-PCR检测多药耐药基因的表达.结果:耐放疗的Tca8113细胞最大耐受剂量为20 Gy,多药耐药基因和蛋白表达水平明显增高. 结论:成功建立耐放疗细胞系,为口腔癌放疗耐药研究提供了细胞模型.     

真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

目的 研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础.方法 采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序.脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测Fas mRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达.通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应.结果 PCR扩增后的产物在约1 008 bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段.经检测Fas基因转染能提高Fas mRNA 表达水平、Fas 蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数.Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01).Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径.MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组 Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性.软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低.结论 Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点.Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长.     

PTEN对鳞癌细胞的抑制作用及其在口腔白斑和鳞癌中的表达

目的：观察转染PTEN的鳞癌细胞的增殖情况及PTEN在口腔白斑及鳞癌中的表达,探讨PTEN基因在口腔鳞癌发展过程中的作用。方法：采用RT-PCR法从正常组织中扩增PTEN基因,构建真核表达载体pcDNA-PTEN,采用脂质体将pcDNA-PTEN转染人舌鳞癌（Tca8113）细胞系,MTT法观察转染前后细胞的增殖情况,流式细胞术检测PTEN基因转染后细胞各周期细胞所占比例。免疫组织化学技术检测口腔白斑（25例）和口腔鳞癌组织（32例）中PT
EN蛋白表达率。结果：成功构建pcDNA-PTEN载体,并获得阳性转染细胞。与空载体组相比,转染pcDNA-PTEN组的舌癌细胞系Tca8113细胞的生长抑制率具有显著性差异(P<0.01);与空载体组比较,转染PTEN基因的Tca8113细胞G0-G1期细胞数增多（P<0.01）, S期细胞减少（P<0.01）;PTEN在口腔鳞癌中表达减少或缺失,且与组织分化程度明显相关（P<0.05）。结论：PTEN的表达可抑制舌鳞癌细胞的生长;PETN在舌鳞癌发展过程中发挥抑癌作用。     

增强DNA聚合酶beta基因表达对人舌癌细胞生物学行为的影响

目的探讨DNA聚合酶beta（polβ）对人舌癌Tca8113细胞增殖和侵袭力的影响。方法运用野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞,分别用RT-PCR、Western blot检测polβ转录及蛋白表达水平;细胞生长实验检测舌癌细胞增殖的变化;Boyden室细胞侵袭实验检测舌癌细胞侵袭能力的变化。结果 pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞获得稳定细胞株,与空白对照组及空载体组比较,polβmRNA及蛋白表达水平均明显增高,野生型polβ导入的舌癌细胞增殖和侵袭能力均明显减弱（P〈0.05）。结论 DNA polβ表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力。     

利用T7噬菌体展示技术构建人舌鳞癌细胞多肽文库

目的:本研究拟构建人舌鳞癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,为进一步筛选和鉴定与舌鳞癌相关的蛋白或多肽打下基础.方法:人舌癌细胞株Tca8113,QiaGen法提取细胞mRNA,逆转录合成双链cDNA后与T7Select 10-3载体连接,体外包装并扩增得到1-7噬菌体展示多肽文库.结果:构建了人舌鳞癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,原始文库重组滴度为鳞癌1.7×106 pfu,扩增后滴度为3×1010 pfu/mL.随机从文库中抽取10个克隆PCR扩增插入片断,电泳结果显示构建的文库中均有插入片段,文库插入率高达100%.所构建的文库插入片断大小在(0.4～1.0)kbp之间.结论:成功构建了人舌癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,为下一步筛选和鉴定与舌癌相关的蛋白或多肽奠定了基础.     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

内毒素对睾丸功能影响的研究进展

众所周知生殖道感染、炎症和其他疾病可抑制雄性生殖功能,但对系统性炎症和疾病引起男性不育的具体机制却所知甚少。内毒素是一种高效炎症激活物,可诱导炎症感染、内毒素血症、败血症休克及多组织器官损伤等,虽然内毒素广泛用于其他系统的炎症研究,但对其在生殖系统炎症的研究较少,因而深入了解内毒素对睾丸功能的影响,有助于进一步理解内毒素所致疾病对雄性生殖功能的影响。本文就内毒素的结构和生物学功能及其对睾丸生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞功能的影响进行了相关研究。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

免疫性肝损伤大鼠枯否细胞对肝星状细胞增殖的影响及芍药苷的作用

目的探讨芍药苷(Pae)通过免疫性肝损伤大鼠枯否细胞(KC)影响肝星状细胞(HSC)的增殖能力。方法用卡介苗加脂多糖诱导大鼠肝损伤模型,肝脏原位灌流分离大鼠KC和HSC,观察共培养的形态学改变,观察Pae作用后的KC培养上清对HSC增殖的影响。结果免疫性肝损伤大鼠KC能明显促进HSC的增殖,在Pae作用后,KC培养上清能抑制HSC的增殖。结论KC是Pae发挥作用的靶细胞之一,Pae可通过作用于KC抑制HSC的增殖。