脑缺血再灌注损伤后室旁区巢蛋白和干细胞因子表达的研究

目的 研究大鼠缺血性脑损伤后室旁区巢蛋白（nestin）和干细胞因子（SCF）基因表达的变化规律，探讨肌苷治疗中枢神经缺血性损伤的作用机制。方法 成年健康雌性SD大鼠68只，以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型，随机分为治疗组（注射肌苷注射液100mg／kg）和对照组（注射相同剂量的生理盐水），各32只，另外4只作假手术组（不插线）。应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织室旁区nestin和SCF的表达。结果 假手术组室旁区nestin和SCF表达很弱。对照组缺血侧nestin的表达除2h、6h、2d、14d以外各时间点均显著高于假手术组（P〈0．01）。治疗组nestin表达较对照组于各时间点均显著升高（P〈0．01）。对照组缺血侧SCF的表达除2h、2d、14d以外各时间点均显著高于假手术组（P〈0．01）。治疗组SCF表达较对照组于各时间点均显著升高（P〈0．01）。结论 肌苷可以促进大鼠脑缺血再灌注后nestin、SCF的表达，推测具有促进神经干细胞生成的作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注血脑屏障超微结构及紧密连接蛋白Occludin变化的研究

目的研究大鼠局灶性脑缺血再灌注模型血脑屏障(BBB)超微结构和Occludin的变化,探讨BBB的结构改变及Occludin的表达异常在再灌注损伤中的作用。方法雄性Wistar大鼠,随机分成假手术组、缺血2h再灌注3h、12h、24h、72h组,应用透射电镜、RT-PCR、免疫组化和Western Blot等方法观察再灌注后不同时相缺血区皮质BBB的超微结构,Occludin mRNA和蛋白水平的变化。结果局灶性脑缺血再灌注后,缺血区皮质BBB的超微结构受损,Occludin mRNA和蛋白表达水平下调。上述变化开始于再灌注后3h,再灌注24h达到高峰,72h开始减弱。结论脑缺血再灌注过程中,BBB的超微结构损伤及Occludin的表达下降加重了缺血再灌注损伤。     

大鼠急性脑缺血后Hephaestin的表达变化

目的 研究大鼠急性局灶性脑缺血后皮质和纹状体Hephaestin表达的变化。方法 线栓法制备大鼠急性大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,在再灌注后的不同时间点应用免疫组化、图像分析以及SDS-PAGE Werstern blot方法检测缺血侧皮质和纹状体的表达变化。结果 MCAO再灌注后大鼠出现大脑中动脉梗死的神经系统损害体征,TTC染色有白色梗死区。Hephaestin在正常大鼠的皮质、纹状体有表达,在急性脑缺血再灌注后12h缺血侧皮质、纹状体表达明显增加并持续到再灌注后48h,在24h时到达高峰(P<0.01),至1周时表达较正常明显减少(P<0.01)。结论 大鼠急性脑缺血再灌注后Hephaestin的表达出现明显的变化,在急性脑缺血的病理生理变化中可能起着重要的作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后FADD mRNA及其蛋白的表达变化

目的观察大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带皮质内Fas死亡结构域相关蛋白（FADD）mRNA及蛋白的表达变化。方法用半定量的逆转录PCR（RT-PCR）法检测缺血2h再灌注不同时间点缺血半暗带皮质内FADD mRNA的表达,Western blot检测FADD蛋白表达的变化。结果缺血半暗带脑皮质内FADD mRNA及其蛋白的表达于缺血灌注后3h明显升高,再灌注后12h达高峰（P＜0．01）,至再灌注后24h明显下降。结论脑缺血再灌注后缺血半暗带皮质内FADD mRNA及蛋白表达均明显增加,提示FADD可能在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。     

17β-雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响

目的观察雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响。方法72只大鼠随机分为假手术组(8只)、实验对照组及雌二醇治疗组,后两组又进一步分为局灶性脑缺血2h再灌注及3h、6h、12h、24h再灌注组,每时间点8只。线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,采用石蜡切片HE及免疫组化染色法检测脑组织损伤及HSP70的表达情况。结果假手术组大鼠未见HSP70的表达;雌二醇治疗组的脑组织缺血半暗带区损伤程度较实验对照组明显减轻;随着再灌注时间的延长,治疗组半暗带区皮质HSP70的表达较对照组上调,且呈先上升后下降趋势,在12h为表达高峰;而纹状体区其表达呈进行性下调趋势。结论17β-雌二醇具有减少脑缺血/再灌注损伤的作用,而半暗带区皮质脑保护蛋白HSP70的表达升高可能其是重要机制之一。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后FAP-1 mRNA及其蛋白的表达变化

目的 观察大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带皮质Fas相关的磷酸酯酶-1(FAP-1)mRNA及蛋白的表达变化.方法 用半定量的逆转录PCR(RT-PCR)法检测缺血2h再灌注不同时间点缺血半暗带皮质内FAP-1mRNA的表达,免疫组化法检测FAP-1蛋白表达的变化.结果 缺血半暗带脑皮质FAP-1 mRNA及其蛋白的表达于缺血灌注后再灌注1h开始明显上升,6h达高峰,24h显著下降.结论 脑缺血再灌注后缺血半暗带皮质内FAP-1 mRNA及蛋白表达均明显增加,提示其可能参与了脑缺血后抗凋亡作用.     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后早期生长反应基因-1 mRNA的表达

目的探讨早期生长反应基因-1( early growth response gene-1,Egr-1)mRNA在大鼠局灶性脑缺血再灌注后的表达情况。方法取10只健康雄性SD大鼠,体重200 ～250 g,应用原位杂交和RT-PCR方法检测大鼠局灶性脑缺血再灌注后Egr-1 mRNA的表达情况。结果 (1)原位杂交结果:假手术组神经元及胶质细胞为轻度阳性表达。缺血2 h再灌注2 h后,缺血侧Egr-1 mRNA细胞阳性表达明显增强。再灌注4 h时Egr-1 mRNA细胞阳性表达最高,再灌注22 h Egr-1 mRNA细胞阳性表达下降,至166 h时下降更加明显,但仍显著高于假手术组。(2)RT-PCR结果:大鼠脑缺血再灌注后缺血侧Egr-1 mRNA的表达明显高于假手术组,P<0.01。动态观察发现,脑缺血2h再灌注2 h后,Egr-1 mRNA即高表达,缺血2 h再灌注4 h达高峰,再灌注46 h已明显下降,但仍高于假手术组,P<0.01,随缺血再灌注时间延长,Egr-1 mRNA表达又逐渐增多,至再灌注166 h其表达亦明显高于假手术组,P<0.01。结论缺血再灌注后Egr-1 mRNA有规律性表达。     

17β-雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响

目的 观察雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织Hsp-70表达的影响.方法 72只大鼠随机分为假手术组（8只）、实验对照组及雌二醇治疗组,后两组又进一步分为局灶性脑缺血2h/再灌注3h、6h、12h、24h 组,每时间点8只.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,采用石蜡切片HE及免疫组化染色法检测脑组织损伤及hsp-70的表达情况.结果 假手术组大鼠未见Hsp-70的表达; 雌二醇治疗组的脑组织缺血半暗带区损伤程度较实验对照组明显减轻;随着再灌注时间的延长,治疗组半暗带区皮质hsp-70的表达较对照组上调,且呈先上升后下降趋势,在12h 为表达高峰;而纹状体区其表达呈进行性下调趋势.结论 17-β雌二醇具有减少脑缺血/再灌注损伤的作用,而半暗带区皮质脑保护蛋白Hsp-70的表达升高可能其是重要机制之一.     

小鼠局灶性脑缺血再灌注后IL-33及其受体的时程表达

目的检测白细胞介素-33(IL-33)及其膜受体ST2和可溶型受体sST2在小鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时程的表达特征。方法利用线栓法闭塞大脑中动脉(MCAO)30 min诱导建立小鼠可逆性局灶性脑缺血再灌注损伤模型,通过半定量RT-PCR检测脑缺血再灌注后6 h、24 h和3 d缺血脑组织中IL-33及其膜受体ST2、凋亡相关蛋白Caspase-8和Caspase-3的mRNA表达水平,并通过免疫组织化学染色观察了IL-33在不同缺血脑区(运动皮质、感觉皮质、海马和纹状体)的时程表达情况;ELISA法检测了小鼠MCAO模型再灌注后不同时间点血清中IL-33及其可溶型受体sST2的表达水平。结果 IL-33 mRNA在缺血后6 h和3 d表达减少,但在24 h无明显改变;凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8在缺血后3个时间点均显著增高,且Caspase-3在6 h和3 d的mRNA表达水平较24 h高;ST2 mRNA在缺血后6 h无减少,但在24 h和3 d有明显减少;除了MCAO 24 h组运动皮质和纹状体阳性染色增加外,IL-33阳性细胞数在缺血后不同时程各脑区均有不同程度减少;缺血后外周血中IL-33的表达量无明显升高或降低,而sST2的表达水平在缺血后6 h即已显著升高。结论脑缺血再灌注后IL-33/ST2信号通路被下调,其与sST2表达增多的效应发挥和神经元凋亡有关。     

亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同脑区iNOS表达的影响

目的 探讨亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同脑区诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法 雄性SD大鼠,随机分为假手术组、常温缺血组和亚低温组.采用线栓法制作大脑中动脉闭塞再灌注模型,于缺血后48h,观察不同组间组织形态学变化,检测不同脑区iNOS蛋白表达、iNOS活性和产物NO含量.结果 常温缺血后48h,纹状体和皮质均检测到iNOS活性升高和免疫阳性反应,且皮质缺血半暗带区iNOS免疫反应明显强于纹状体和皮质缺血核心区.亚低温明显缩小梗死面积,抑制皮质和纹状体iNOS活性,明显下调半暗带区iNOS蛋白表达,减少NO产生.结论亚低温可能通过减少半暗带区iNOS蛋白表达,抑制iNOS活性,减少NO产生而起到脑保护作用.     

3-硝基丙酸预处理对大鼠局灶性脑缺血Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

目的探讨3-硝基丙酸(3-NPA)预处理对大鼠局灶性脑缺血半暗带Bc l-2和Bax mRNA表达的影响。方法将大鼠腹腔注射3-NPA 20 mg/kg,3 d后制作局灶性脑缺血再灌注模型;采用逆转录聚合酶链反应,观察3-NPA预处理对脑缺血再灌注1 h、6 h、12 h、24 h及48 h额顶部皮质Bc l-2和Bax mRNA表达的影响,并与假手术组和缺血再灌注组比较。结果与假手术组比较,缺血再灌注组和3-NPA预处理组各时间点Bc l-2和Bax mRNA表达极显著增强(均P<0.01);与缺血再灌注组比较,3-NPA预处理组各时间点Bc l-2mRNA表达显著增强(均P<0.05),再灌注12~48 h Bax mRNA的表达显著降低(均P<0.05)。结论增强Bc l-2的表达、抑制Bax的表达,可能是3-NPA预处理抑制细胞凋亡、诱导脑缺血耐受的机制之一。     

PPAPγ和缺血再灌注脑组织损伤关系的研究

目的明确实验性缺血再灌注脑组织PPAPγmRNA和蛋白的表达变化,结合相关文献分析PPAPγ和缺血再灌注脑组织损伤的关系。方法建立SD大鼠MCAO缺血90min再灌注模型。实验分为对照组、假手术组和缺血再灌注组。缺血再灌注组取缺血后12h、24h和48h3个时间点进行观察。用RT-PCR方法及Western blotting方法分别检测PPARγmRNA和蛋白的表达。结果脑缺血再灌注组PPARγmRNA和蛋白表达较正常对照组和假手术组明显降低。通过对缺血后12h、24h和48h3个时间点的动态变化观察显示,缺血后12h表达最低,并且随缺血后时间的推移,其表达逐渐增加,存在显著性差异。但缺血后48h的表达值仍低于正常对照组和假手术组。结论缺血再灌注脑组织PPARγ表达下调可能通过炎性机制参与了脑缺血病理损伤,提示针对PPARγ作为一靶点进行干预可能对于缺血性脑血管病的治疗是一个新的研究方向。     

脑缺血再灌注大鼠皮质NMDA受体亚单位NR2A/B蛋白的表达变化

目的 采用免疫细胞化学技术，探讨急性脑缺血再灌注不同时间段大鼠脑顶皮质NMDA受体亚单位NR2A及NR2B蛋白的表达变化。方法 雄性Wistar大鼠70只,随机分成正常对照组、假手术对照组、脑缺血再灌注对照组；以颈动脉引流法行全脑缺血7min再灌注造模，术后分6h、24h、72h3个时间段取脑．脑组织恒冷箱连续冠状切片,免疫细胞化学ABC反应，图像分析系统行顶皮质Ⅰ区V层免疫阳性面积检测。结果 （1）麻醉及假手术可导致顶皮质NR2A、NR2B蛋白表达短暂增多，24h内恢复正常；（2）缺血再灌注后6h前后形成表达高峰,24h恢复正常，随后表达急剧减少，持续至72h以后。结论（1）脑缺血再灌注可导致顶皮质神经元NR2A、NR2B蛋白表达变化，且表达存在明显的时间依赖性；（2）缺血再灌注早期皮质NR2A、NR2B蛋白高度表达可能是导致迟发性神经元丢失的重要原因。     

P-选择素在大鼠全脑缺血再灌注微血管内皮细胞损伤中的作用

目的 探讨P-选择素（P-selectin)在大鼠全脑缺血再灌注血管内皮细胞损伤过程中的作用。方法 将大鼠随机分为假手术组和脑缺血30min再灌注1h,3h,6h,12h,24h,48h,72h组，动物模型采用全脑缺血模型三血管阻塞法，用免疫组化法检测脑组织缺血再灌注不同时间点FⅧ相关抗原（vWF)的表达以标记内皮细胞损伤与修复过程，同时用原位杂交方法检测P-选择素mRNA的表达变化。结果 假手术对照组未见P-选择素mRNA表达，脑缺血再灌注后1h表达出现上调，12-24h达高峰，72h仍有表达，FⅧ相关抗原在假手术组呈强阳性表达，脑缺血再灌注后3h表达下降，24-48h表达最低，72h表达开始恢复，结论 脑缺血再灌注微血管内皮细胞损伤主要发生在早期，此过程中P-选择素mRNA表达上调，说明P-选择素参与了脑缺血后内皮细胞的损伤过程。     

大鼠局灶性脑缺血时细胞凋亡与c-fos表达

目的：研究凋亡细胞在脑缺血及再灌注后的时空表达方式及原癌基因ｃ－ｆｏｓ的表达，以期探讨脑缺血时ｃ－ｆｏｓ表达与细胞凋亡的关系。方法：用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型，ＤＮＡ缺口末端标记法原位检测细胞凋亡，免疫组化检测ｃ－ｆｏｓ的表达。结果：缺血侧鼠脑凋亡细胞数随再灌注时间延长而增多，凋亡细胞主要分布于额顶叶皮层与纹状体，以梗死灶边缘区密度最高。正常组、假手术组未见ｃ－ｆｏｓ表达，缺血及再灌注各组     

大鼠脑缺血再灌注后不同时间段中枢组织 ACTH样蛋白表达变化

目的采用免疫细胞化学技术,探讨大鼠脑缺血再灌注后不同时期中枢几个重要脑区促肾上腺皮质激素样阳性免疫物的表达变化。方法雄性Wistar大鼠70只,随机分成正常对照组、假手术对照组、脑缺血再灌注组。以颈动脉引流法行全脑缺血再灌注造模,术后分6h、24h、72h三个时间段取脑,脑组织恒冷箱连续冠状切片,免疫细胞化学ABC反应,图像分析系统行顶皮质1区、下丘脑室旁核、丘脑室旁核、海马CAl区促肾上腺皮质激素样阳性免疫面积、平均吸光度检测。结果镜下观察,促肾上腺皮质激素样阳性免疫物呈深棕色,深染胞核广泛分布于中枢皮质、海马、丘脑及下丘脑等各脑区,核仁清晰可辩。在丘脑及下丘脑区域散在分布有“串珠”状阳性纤维。图像分析结果显示,假手术对照组、脑缺血再灌注组两组阳性免疫面积和平均吸光度值呈同步变化。从术后6h开始,假手术对照组、脑缺血再灌注组两组均较正常对照组显著升高,术后24h达高峰(P<0.05),然后逐渐回落。在三个不同时间段,三组间均存在显著差异(P<0.05),术后6h及24h脑缺血再灌注组>假手术对照组>正常对照组;术后72h假手术对照组>正常对照组>脑缺血再灌注组。结论在脑缺血再灌注不同时间段,中枢神经元促肾上腺皮质激素样阳性免疫物表达呈现明显的时间规律;促肾上腺皮质激素可能在神经元功能调控、中枢内环境控制及脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用。     

脑缺血大鼠脑皮质中前蛋白转化酶枯草溶菌素9 mRNA的经时表达

氧化的低密度脂蛋白是脑血管病的危险因素,而前蛋白转化酶枯草溶菌素9能升高低密度脂蛋白的水平。因此,课题组设想前蛋白转化酶枯草溶菌素9可能在缺血性脑血管病中发挥作用。实验以阻塞大鼠大脑中动脉100 min后进行再灌注建立短暂性局灶性脑缺血模型,原位杂交染色发现脑缺血大鼠脑皮质内前蛋白转化酶枯草溶菌素9 mRNA表达随再灌注时间延长而增高。说明局灶性短暂脑缺血可上调大鼠缺血脑皮质内前蛋白转化酶枯草溶菌素9 mRNA的表达。 关键词：前蛋白转化酶枯草溶菌素9 mRNA;皮质;脑缺血;大鼠;神经再生     

缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤热休克蛋白70影响

目的探讨缺血后处理(Postcond)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤热休克蛋白70(HSP70)表达的影响,以探讨其脑保护的机制。方法成年健康SD大鼠45只,随机分为假手术组、缺血再灌注组、缺血后处理组,应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型,于灌注24h后断头留取大脑皮质组织,用免疫组化、Western blot检测HSP70蛋白的含量;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HSP70mRNA表达水平。结果局灶性脑缺血再灌注24h后脑皮质内HSP70mRNA和HSP70蛋白的表达增加(P0.05)。应用缺血后处理能显著地促进脑缺血再灌注后脑组织HSP70mRNA和HSP70蛋白的表达(P0.05)。结论缺血后处理促进大鼠局灶性脑缺血再灌注皮质内HSP70的表达,这可能是其脑保护作用的部分机制。     

大鼠短暂脑缺血后海马区c-fos mRNA和FOS蛋白表达的时间规律

目的 探讨大鼠脑缺血-再灌注后脑海马区c-fos mRNA和FOS蛋白表达规律。方法 采用左侧大脑中动脉插入丝线结扎(LMCAO)方法制作大鼠脑缺血-再灌注缺血模型，分别按照30min至7d的不同灌注时间取材，应用原位杂交方法标记各实验组大鼠脑组织海马区c-for mRNA表达数量；应用免疫组化方法标记各实验组大鼠脑组织中海马区FOS阳性神经元数量。结果 c-fos mRNA阳性细胞在MCAO缺血再灌注1h开始表达，2h达高峰，至2d时c-fos mRNA阳性细胞表达基本消失；c-fos免疫活性细胞从2h开始表达，4h达高峰，4d时表达基本消失。脑缺血—再灌注后c-fos mRNA与FOS蛋白在海马区表达具有一定的时间上规律性。结论 本研究证明了大鼠MCAO缺血—再灌注后可诱发FOS蛋白和c-fos mRNA表达增加，且基因和蛋白的表达均具有一定的时间规律性和相关性。     

大鼠脑缺血再灌注后TNF—α，IL—β及细胞间粘附分子—1 mRNA的表达

目的：研究脑缺血再灌注后TNF－α,IL-β及ICAM－1在mRNA的表达变化,以探讨它们在脑再灌注损伤中的作用。／方法：提取局灶性脑缺血再灌注大鼠的RNA,用半定量逆转录－多聚酶链反应（RTPCR）测定再灌注不同时间点TNF－α,IL-β及ICAM－1在mRNA的表达水平,结果：在缺血侧,TNF－α,IL-β mRNA的表达变化相似,缺血及再灌注后表达增加,并在再灌注4h后达到顶峰,而CAM－1 mRNA在再灌注10h后达到顶峰,三类mRNA水平的升高可以保持到再灌注后3d,在缺血对侧,与假手术组比较,这三类mRNA水平有所增加,但是远低于缺血侧的mRNA水平。结论：TNF－α,IL-β及ICAM－1 mRNA在再灌注后不同时间的表达变化表明它们在缺血再灌注损伤中起重要作用。