急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响

目的:研究急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及L型电压依赖性钙通道(VDCC)阻断剂硝苯地平的作用,为缺氧性肺动脉高压发病机制的进一步研究提供理论依据.方法:胶原酶消化法培养大鼠远端PVSMC,利用荧光显微镜和细胞内钙浓度检测系统观测急性缺氧(4％O2)、高钾(60 mmol/L KCl)溶液对PVSMC的[Ca2+]i影响及硝苯地平的干预作用.结果:对照组PVSMC的[Ca2+]i随时间变化维持基线水平;缺氧组PVSMC急性缺氧后,[Ca2+]i迅速升高并维持平台水平,△[Ca2+]i达82.83 nmol/L士23.03 nmol/L;硝苯地平干预组PVSMC予急性缺氧和5μmol/L硝苯地平干预后,[Ca2+]i升高幅度较小;高钾溶液孵育PVSMC后,[Ca2+]i迅速增高,5 μmol/L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca2+]i对高钾溶液的反应.结论:急性缺氧可使大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高,其机制可能与激活PVSMC的VDCC和另外的非VDCC依赖的钙通道导致细胞外Ca2+内流有关.     

皮质酮对原代培养的海马神经元及其[Ca2+]i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的:探讨皮质酮(CORT)对培养的海马神经元及其[Ca2 ]i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的影响和可能的机制。方法:海马神经元被分为不同终浓度的CORT处理组、CORT MK-8 0 1或高浓度葡萄糖组。采用MTT法、流式细胞术、荧光标记和免疫细胞化学法,观察海马神经元活力、死亡方式[、Ca2 ]i和CaMKⅡ表达的变化规律。结果:1 0-6和1 0-5mol/L CORT组,其海马神经元的活力明显降低,分别以凋亡和坏死为主,并使海马神经元[Ca2 ]i显著升高;CaMKⅡ的表达明显减少。MK-8 0 1和高浓度葡萄糖均能拮抗1 0-6mol/L CORT对海马神经元的损伤作用。结论:在CORT的作用下,海马神经元发生凋亡和坏死;[Ca2 ]i升高可能既是海马神经元损伤的结果,又是引起其发生凋亡和CaMKⅡ表达下降的原因。     

NO在外源性高浓度Ca~(2 )损伤心肌线粒体中的作用

目的 :探讨一氧化氮在外源性高浓度Ca2 损伤心肌线粒体中的作用。方法 :正常心肌线粒体分为单纯L -精氨酸 (L -Arg)组、Ca2 损伤组和左旋硝基精氨酸甲酯 (L -NAME)保护组 ,分别于含有 2 0 μmol/LEDTA、10 0 μmol/LCaCl2 以及 1μmol/LL -NAME 10 0 μmol/LCaCl2 的反应介质中孵育 ,然后测定线粒体活力、膜电位以及NO含量。结果 :Ca2 损伤组线粒体活力、膜电位明显下降 ,而NO-2 /NO-3 含量升高 ,且线粒体活力、膜电位与NO-2 /NO-3 含量呈显著负相关 (r=- 0 .5 2 97,P <0 0 1;r=- 0 6 0 41,P <0 0 1) ;L -NAME保护组线粒体活力与膜电位均明显高于Ca2 损伤组 ,但仍低于L -Arg组 ,而NO-2 /NO-3 含量低于Ca2 损伤组 ,且与L -Arg组无明显差异。结论 :外源性Ca2 可激活线粒体一氧化氮合酶 ,使NO生成增多 ,后者在线粒体活力与膜电位降低中起重要作用。     

皮质酮对原代培养的海马神经元及其Ca~(2+)/CaMKII的影响

在培养液中加入 10 7、10 6和 10 5浓度(mol/L)的皮质酮,采用MTT染色测定、Fura 2 /AM的荧光标记以及Western印迹的方法,观察了不同浓度的皮质酮作用下海马神经元形态学和细胞存活率的变化以及胞浆内游离钙离子浓度 [Ca2+ ]i和CaMKII表达的变化规律, 探讨其对原代培养的大鼠海马神经元及其Ca2+ /CaMKII的影响和可能的机制。结果发现: 10 6、10 5浓度的皮质酮对海马神经元的形态学影响较大,与对照组比较,细胞存活率明显降低; [Ca2+ ]i分别为 113. 1022±16. 9716、155.3794±20. 7727;CaMKII的表达也明显减少;三者的变化均显著 (P<0. 01 ),而 10 7浓度的皮质酮对上述指标影响不大 (P>0.05)。此外,相关性分析表明: [Ca2+ ]i和CaMKII的表达呈现负相关(P<0. 05)。以上结果提示,皮质酮对大鼠海马神经元的作用存在浓度依赖效应,浓度越高,对大鼠海马神经元的损伤越大,同时也验证了皮质酮是啮齿类动物的主要的应激激素。     

缺氧预处理对自发性高血压大鼠心肌细胞内钙的影响

目的:探讨缺氧预处理对后继缺氧再给氧所致心肌细胞内钙超载的影响及蛋白激酶C(PKC)和百日咳毒素(PTX)敏感的G-蛋白在缺氧预处理的作用.方法:循环灌流法分离自发性高血压大鼠(SHR)肥大心肌细胞,用Fu ra-2AM测定钙浓度.结果:[Ca2+].为1.0 mmol/L时,预处理组缺氧再给氧后其心肌细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为(194.0±24.8) nmol/L,未预处理组为(297.5 ±24.5) nmol/L;无外钙预处理组缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i为(162.0 ±30.7) nmol/L,未预处理组为(236.5±28.3) nmol/L,提示缺氧预处理可减少缺氧再给氧所致心肌细胞内钙释放及外钙内流.在[Ca2+].为1.0 mmol/L组,于预处理前分别预先给予PKC拮抗剂Staurosporine(10 nmol/L)及Gi-蛋白失活剂百日咳毒素(PTX,200 ng /L),可见经后继缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i分别为(264.8±19.3)及(25 8.0±27.7) nmol/L,高于缺氧预处理组但低于未预处理组.结论:SH R肥大心肌细胞,缺氧预处理可减轻后继缺氧再给氧所致心肌细胞内钙超载;PKC及PTX敏感的G- 蛋白可能部分参与缺氧预处理的保护作用.     

低氧与缺血诱导培养海马和皮质神经元钙应答反应的比较

目的：钙作为重要信使参与多种生理和病理代谢过程,而且在缺血性神经元损伤机制中起着重要的作用。本实验模拟脑缺血的病理生化改变,用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）和Fluo-3荧光探针标记技术,观察低氧缺血状态下体外培养的海马,皮质神经元内钙浓度的变化。方法：用100μmol/L氰化钠造成细胞低氧;100μmol/L氰化钠和3.5mmol/L碘醋酸盐模拟在体完全性脑缺血;1mmol/LL-谷氨酸模拟在体脑缺血时兴奋性氨基酸大量释放;无葡萄糖介质剥夺细胞能量代谢的底物。结果：低氧使海马神经元[Ca^2 ]i显著升高,但有两种不同的钙振荡现象,谷氨酸引起海马神经元[Ca^2 ]i持续升高,但峰值低于低氧组,缺血组未见[Ca^2 ]i大幅升高,葡萄糖缺如不引起[Ca^2 ]i升高,结论：低氧和谷氨酸引起的神经元损害是能量依赖性的,轻度酸中毒可阻止胞内Ca^ 升高,糖对神经元具有保护作用,但单纯无糖引起的神经元损害与Ca^2 超载机制无关。     

H2S通过cAMP介导PI3-K/Akt/P70S6K通路抑制缺氧/复氧后神经元的凋亡

目的: 研究H₂S对缺氧/复氧后神经元存活信号转导通路PI₃K/Akt/P70S6K的影响。方法: 取96孔和6孔培养板上培养7 d的海马神经元，正常培养组（C组）神经元按正常培养方法培养。NaHS组在进行缺氧/复氧时加入NaHS使其终浓度为150 μmol/L。Tri组、Rap组和Tri+Rap组在加入150 μmol/L NaHS的同时分别加入triciribin 10 μmol/L、rapamycin 10 nmol/L或triciribin 10 μmol/L+rapamycin 10 nmol/L。96孔培养板的神经元进行细胞存活力的检测。6孔培养板的神经元进行神经元纯度鉴定、神经元凋亡、cAMP和PI₃-K、Akt和P70S6K蛋白表达的检测。结果: NaHS显著增加了cAMP的浓度和PI₃、Akt、P70S6K蛋白的表达，同时增加了神经元存活率、降低了神经元凋亡率（P<0.01 vs C组和A/R组）。Triciribin抑制了Akt和P70S6K表达同时降低了神经元存活率、升高了神经元凋亡率（P<0.05,P<0.01 vs NaHS组）。Rapamycin抑制了P70S6K表达同时降低了神经元存活率、升高了神经元凋亡率（P<0.05,P<0.01 vs NaHS组）。结论： H₂S通过cAMP激活了PI₃K/Akt/P70S6K信号通路，抑制缺氧/复氧后海马神经元的凋亡。     

活细胞钙离子浓度荧光显微检测系统的研制和应用

研制了活细胞钙离子浓度荧光显微检测系统。该系统的工作原理是 :氙灯发射的光线被椭球面镜聚焦后以衍射光栅分光 ,通过光纤、双路耦合聚光镜和物镜将单色光纤入样本平面以激发细胞中的钙离子荧光探针发出荧光 ,最后用光电倍增管检测荧光信号。使用该系统 ,测定了高K 去极化刺激下PC12细胞 (大鼠嗜铬细胞瘤细胞 )内 [Ca2 ]i 变化的动态特性曲线。结果表明 :静息状态下PC12细胞内 [Ca2 ]i 为 80 .0±15 .0nmol/L ,高K 去极化刺激可使PC12细胞内 [Ca2 ]i 增加到 1.9± 0 .2 μmol/L ,上升至峰值时间约为2 0 .1s。表明此系统可以满足检测活体细胞 [Ca2 ]i 的需要。     

芦荟大黄素影响巨噬细胞升高[Ca~(2 )]_i和释放TNF-α的作用特征

应用MTT法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)量,同时利用细胞钙离子成像分析系统检测单细胞内自由钙离子浓度([Ca2 ]i)的动态变化,来研究芦荟大黄素(aloe-emodin)对正常的和细菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞(PMψ)释放TNF-α和[Ca2 ]i的影响。结果显示,芦荟大黄素可较强活化正常PMψ释放TNF-α,同时诱发正常PMψ[Ca2 ]i呈振荡式变化,[Ca2 ]i变化主要来源于胞外钙内流。药物升高细胞[Ca2 ]i和促进TNF-α释放都随其浓度增加而增强。芦荟大黄素对LPS刺激的PMψ的影响有较复杂的剂量依赖性特征:低浓度芦荟大黄素(10-7 mol／L、10-6 mol／L)抑制LPS诱发的[Ca2 ]i升高和TNF-α的释放;10-5 mol／L的芦荟大黄素则对LPS诱发的[Ca2 ]i峰及TNF-α释放量没有明显影响。以上结果说明,芦荟大黄素对PMψ释放FNF-α和升高[Ca2 ]i表现出双向调节作用,但其活化正常PMψ和抑制LPS的刺激作用有相反的量一效关系。同时芦荟大黄素对PMψ的[Ca2 ]i动力学的调制,是其调节细胞释放TNF-α的信号传导通路中的重要环节。     

P2Y_(13)受体激活促进脊髓背角小胶质细胞钙浓度升高

目的:观察ADP对培养的脊髓背角小胶质细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响及作用机制。方法:培养纯化新生SD大鼠脊髓背角小胶质细胞,免疫组化观察P2Y13受体表达,激光共聚焦显微镜检测ADP作用下,小胶质细胞[Ca2+]i的变化。结果:大鼠脊髓背角小胶质细胞表达P2Y13受体,ADP可导致培养的脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]i快速增高,且呈现剂量依赖性;P2Y13受体拮抗剂MRS2211(100μmol/L)能基本阻断ADP的作用,而P2Y1受体拮抗剂MRS2179(100μmol/L)、P2Y12受体拮抗剂MRS2395(100μmol/L)均不影响ADP致小胶质细胞[Ca2+]i升高的效应。结论:ADP可能通过P2Y13受体途径,导致培养的脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]快速升高。