精子蛋白SP22在毕赤氏酵母中的表达、纯化和鉴定

目的:克隆人睾丸精子蛋白SP22基因在毕赤氏酵母中表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:RT-PCR克隆出睾丸SP22基因,导入pGEM-T克隆载体。再亚克隆到酵母真核分泌型表达载体pHIL-S1。电击转化将重组质粒pHIL-S1/SP22导入GS115酵母菌株。筛选出阳性克隆,以甲醇诱导分泌表达。镍离子亲和层析法从培养上清中纯化目的蛋白。结果:SP22编码序列与人致癌基因DJ1基本相同。重组质粒正确插入酵母基因组后,甲醇诱导SP22表达并分泌至培养上清中,表达量约占上清总蛋白的20%。纯化出的目的蛋白为糖蛋白,能被免疫印迹证实。结论:成功构建了酵母GS115/pHIL-S1/SP22重组型表达菌株,并纯化获得糖基化的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构及生理功能打下了基础。     

重组早孕因子(EPF)的表达、纯化及鉴定

目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF)。再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性。结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA。EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白。Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性。结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础。     

Expression, Purification and Identification of Recombinant Early Pregnancy Factor(EPF)

目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白.方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF).再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白.用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性.结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA.EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白.Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性.结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础.     

志贺毒素2A-促黄体生成素释放激素重组毒素的构建、表达及其意义

目的 构建一种对子宫颈癌HeLa细胞有特异性杀伤作用的志贺毒素2A-促黄体生成素释放激素(Stx2A-LHRH)重组毒素,以探索其成为新型靶向药物的可能性。方法 用聚合酶链反应(PCR)技术扩增Stx2A-LHRH DNA片段,克隆至pET-20b( )质粒中,酶切鉴定及测序证明成功地构建了重组毒素表达质粒pET-Stx2A-LHRH,将其转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳及凝胶薄层扫描分析Stx2A-LHRH重组毒素的表达情况。倒置显微镜下观察Stx2A-LHRH对HeLa细胞的作用。结果 SDS-PAGE电泳分析显示,在实验上清液中,诱导出相对分子质量为38000的融合蛋白,说明该载体表达了Stx2A-LHRH重组毒素,且其表达量占上清液中总蛋白的10．32％。加入Stx2A-LHRH重组毒素后,宫颈癌HeLa细胞几乎全部死亡。结论 成功构建了Stx2A-LHRH重组毒素,为研制治疗子宫颈癌的新型药物提供了理论依据。     

人输卵管蛋白全长cDNA克隆及真核细胞中的表达

目的:克隆人输卵管蛋白(hOviductin)全长cDNA序列,真核细胞中表达,并了解hOviductin是否与大鼠卵母细胞结合。方法:构建人输卵管黏膜上皮细胞cDNA文库,以~(32)P标记的兔输卵管蛋白全长cDNA序列为探针,自文库中筛选hOviductin全长cDNA序列。将获得的hOviductin编码区cDNA序列插入pEGFP-N1真核表达载体,转染HeLa细胞,表达分泌重组的绿色荧光蛋白(EGFP)-hOviductin,并估量其浓度。激光扫描共聚焦显微镜下观察EGFP-hOviductin与大鼠卵巢的卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)或去除透明带后的裸卵的结合情况。结果:所构建的cDNA文库重组率为98.5％,滴度为1.1×10~6pfu/mL。克隆所得hOviductin全长cDNA约为2500 bp,Gen-Bank的登录号为AY189737。EGFP-hOviductin在条件培液中的浓度为0.236 nmol/L,能结合在去透明带的大鼠裸卵质膜外表面,而未见其与COC结合。结论:hOviductin能在HeLa细胞中表达分泌,其分泌产物可结合于大鼠裸卵质膜外表面。     

宫颈癌细胞TRAIL死亡受体和诱骗受体表达的研究

目的:检测宫颈癌细胞HeLa表面TRAIL死亡受体(DR4、DR5)及诱骗受体(DcR1、DcR2)的表达差异,研究HeLa细胞系对TRAIL蛋白诱导的凋亡敏感程度。方法:应用MTT法检测TRAIL蛋白对人宫颈癌细胞HeLa的诱导凋亡率,分析宫颈癌细胞对TRAIL蛋白的敏感程度;应用逆转录聚合酶链反应技术(RTPCR)、流式细胞术,检测人宫颈癌细胞HeLa表面TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2mRNA和蛋白的表达,分析宫颈癌细胞表面死亡受体DR4、DR5与诱骗受体DcR1、DcR2表达的相对程度。结果:HeLa细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡反应有较高的敏感性,在较低浓度(100ng/ml)TRAIL的作用下,即有接近50%的细胞杀伤率。HeLa细胞表面DR4、DR5受体mRNA的表达明显高于DcR1、DcR2受体,差异有显著性(P<0.01),DR4、DR5受体之间及DcR1、DcR2受体之间表达差异无显著性(P>0.01)。HeLa细胞表面DcR1,DcR2受体蛋白的表达率(17.7%、5.3%)明显较DR4,DR5受体表达率(99.9%、97.8%)低(P<0.01)。结论:宫颈癌细胞HeLa对TRAIL诱导的细胞凋亡反应有较高的敏感性,而且DcR1、DcR2在宫颈癌细胞表面的表达程度相对低于DR4、DR5,将TRAIL用于治疗宫颈癌具有潜在的应用前景。     

外源性PUMA表达对人乳头瘤病毒阳性宫颈癌放疗敏感性的影响

目的 探讨外源性PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因对人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌放疗敏感性的影响.方法 以重组腺病毒为载体,将PUMA基因导入HPV阳性宫颈癌细胞HeLa和caSki.应用MTT法比较携带PUMA的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-PUMA)和携带野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-p53)对HeLa和Caski细胞增殖的影响,平板克隆方法检测Ad-PUMA与X射线联合应用后对细胞生长的影响,并通过DAPI染色、流式细胞检术检测细胞凋亡情况.Western Blot法检测x射线处理后HeLa细胞PUMA表达.结果 (1)Ad-PUMA能够明显抑制HeLa和CaSki细胞增殖,增加细胞凋亡,而Ad-p53对细胞生长无明显抑制作用.(2)X射线能够诱导HeLa细胞PUMA表达升高,具有时间和剂量效应.(3)Ad-PUMA与X射线联合应用后可显著增加细胞凋亡,减少平板克隆形成数,但Ad-PUMA对X射线引起的G2期阻滞无明显影响.结论 PUMA在放射线诱导肿瘤细胞凋亡的过程中发挥作用.Ad-PUMA抑制宫颈癌细胞增殖,诱导细胞凋亡.Ad-PUMA与X射线联合应用后显著提高宫颈癌细胞放疗敏感性.     

沙眼衣原体热休克蛋白10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:从临床标本中获得构建真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染Hela细胞获得cHSP10。方法:用PCR法从金标法检测为阳性的临床标本中扩增cHSP10基因片断,重组λpMD18-T克隆载体。将pMD18-T/cHSP10中的外源基因片断经酶切鉴定后,克隆入λpcDNA3.1(+)中,经序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将该重组体转染Hela细胞,间接免疫荧光法观察目的基因的表达。结果:PCR扩增得到的306bpcHSP基因全长,序列测定与GenBank(M58027)发布序列一致;构建得到cHSP10基因真核表达载体;该真核表达载体在Hela细胞表达cHSP10。结论:成功构建了cHSP10基因真核表达载体,该重组质粒能在Hela细胞中表达cHSP10。     

肿瘤抑制基因Nm23-M1原核表达载体的构建和表达

目的:构建鼠Nm23-M1基因的原核表达载体并进行表达。方法:应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术扩增Nm23-M1基因,将其克隆于pQE30质粒中,测序正确后,构建重组体pQE30-Nm23-M1,在大肠杆菌中诱导NM23-M1蛋白表达。结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示,在分子量大约17.5kD处有一诱导表达蛋白带,表达蛋白量占菌体蛋白量的15%,通过Westernblot证实,表达产物与抗人Nm23-H1单克隆抗体有特异性免疫反应。经Ni-NTA柱纯化,获得电泳均一性为92%的重组蛋白。结论:成功构建Nm23-M1表达载体,并获得了重组NM23-M1蛋白。     

HBXIP真核表达载体及转基因人子宫内膜癌细胞系的构建研究

目的构建携带肝炎BX-相互作用蛋白(HBXIP)基因的重组pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP质粒,将其转染人子宫内膜癌HEC-1A,建立稳定表达HBXIP蛋白的细胞株,并检测HBXIP在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达。方法实验于2014—2015年于中国医科大学附属第一医院中心实验室进行。聚合酶链反应(PCR)逆转录c DNA扩增HBXIP基因全长,亚克隆到真核表达载体pc DNA3.1-myc-his A内,构建出重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP,酶切及DNA测序证实重组质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP正确插入HBXIP的核苷酸序列。证实HBXIP基因成功插入空载体pc DNA3.1-myc-his A,脂质体法将pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞,并用Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌细胞HEC-1A中HBXIP蛋白表达。结果 (1)HBXIP总RNA在提取进程中没有发生明显的降解,说明获得的RNA和m RNA完整。PCR扩增后的产物在约276 bp处出现明显的特异性条带,与理论预计的c DNA片段长度一致。(2)HBXIP基因真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP成功构建,重组质粒经pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的HBXIP基因片段。(3)Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中HBXIP蛋白表达。pc DNA3.1-myc-his A组与pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP组HBXIP蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HBXIP基因片段被成功插入真核表达载体质粒pc DNA3.1-myc-his A的多克隆位点,成功构建了HBXIP基因的重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP。构建的HBXIP基因重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞后,可在HEC-1A细胞中稳定表达,为进一步研究HBXIP基因奠定了基础。     

重组人色素上皮衍生因子在真核细胞SP2/0中的瞬时表达及活性鉴定

目的 构建抑制早产儿视网膜病新生血管形成的重组人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)真核表达载体,检测其在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中的瞬时表达.方法 根据已知的GenBank中人PEDF cDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物,以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板,经聚合酶链反应技术扩增人PEDF基因,定向克隆至真核表达载体pIRESneo3中,获得重组表达质粒pIRESneo3-PEDF.将重组质粒pIRESneo3-PEDF与脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000混合后转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,采用酶联免疫吸附试验及Western印迹对表达产物进行鉴定.收集转染细胞培养液上清,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测重组PEDF活性.结果 聚合酶链反应技术、酶切鉴定和测序结果表明,pIRESneo3-PEDF表达载体构建成功.脂质体法将表达质粒成功转染到SP2/0中,经培养,可分泌表达PEDF,且经Western印迹检测证明为人PEDF,分子量为50 000.转染36 h上清液中PEDF浓度最高,为(0.92±0.04) μg/ml.转染36 h细胞培养液上清对人脐静脉内皮细胞的抑制作用最强(P<0.05).结论 成功构建人PEDF真核表达质粒pIRESneo3-PEDF,转染细胞可瞬时分泌表达有活性的人PEDF,对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制作用,为开展下一步稳定转染表达及蛋白纯化奠定基础,为早产儿视网膜病的防治带来新的希望.

Abstract：

Objective To construct eukaryotic expression plasmid pIRESneo3-pigment epithelium-derived factor (PEDF) and detect its transient expression in SP2/0 cells. Methods Specific primers were designed based on the mature peptide sequence of human PEDF cDNA in the GenBank. Human PEDF gene was cloned into the eukaryotic expression vector pIRESneo3. The PEDF DNA was transfected into SP2/0 with LipofectamineTM 2000. The recombinant human PEDF protein expressed in SP2/0 cell culture supernatant was identified by Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay. The biological activity of the recombinant human PEDF was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-z-y1)-2,5-diphenytetrazolium bromide(MTT) method. Results PCR amplification, restriction enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the mature peptide sequence of human PEDF cDNA was successfully cloned into the eukaryotic expression vector pIRESneo3. And the plasmid was transfected into SP2/0 cells, which could secret PEDF. Western blot analysis showed that there was only one obvious band at the position of relative molecular weight of 50 000, and it is equivalent to the expected value. Enzyme-linked immunosorbent assay suggested that the content of PEDF began to rise after transfection, and peaked at 36 h [(0.92±0.04) μg/ml]. The proliferation of human umbilical vein endothelial cell line was significantly inhibited by supernatant after transfection of 36 h (P<0.05). Conclusions The eukaryotic expression plasmid pIRESneo3-PEDF had been successfully constructed and active human PEDF was transiently secreted, which made a foundation for further study of stable expression and purification of PEDF. This protein could be a potential medication for preventing and managing retinopathy of prematurity.     

卵巢癌抗独特型单链抗体3D5ScFv/鼠GM-CSF融合蛋白(3D5mGM)的构建、表达

【摘要】目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体3D5ScFv和鼠GM—CSF融合蛋白(3D5mGM)，并对其活性进行鉴定。方法用DNA重组技术，将3D5ScFv基因与鼠粒细胞集落刺激因子(mGM—CSF)基因融合，插入到pET30a( )中，构建重组质粒pET30a一3D5mGM，转化大肠杆菌B121(DE3)，IPrG诱导，以包涵体形式获高效表达，超声破碎细菌细胞获得包涵体，用8mol／L尿素溶解包涵体后直接稀释复性，SDS-PAGE分析蛋白纯度，ELISA和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性。结果复性蛋白纯度达90％以上。表达的融合蛋白能够与OC125单抗结合，也能与大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合。并能刺激mGM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖。结论表达的融合蛋白3D5mGM保留了两种蛋白的活性，为进一步研究该融合蛋白治疗卵巢癌的可能性提供了基础。     

人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定

目的:克隆人子宫内膜容受性标志分子HoxA10基因的cDNA,转入真核细胞载体,并在293T细胞中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从人子宫内膜组织中扩增HoxA10基因的cDNA编码区序列,将PCR产物克隆至pCMV-HA真核表达载体中,测序鉴定该载体。以LipofectamineTM2000将该载体转染入293T细胞中,Western blotting检测HoxA10蛋白的表达。结果:PCR扩增出的人HoxA10基因cDNA正确克隆到了pCMV-HA载体,成功构建了pCMV-HA-HoxA10重组载体;将其转染入293T细胞,用HoxA10和HA抗体进行Western blotting,均检测到了融合蛋白的表达。结论:携带有HA蛋白标签的人HoxA10基因的真核表达载体pCMV-HA-HoxA10克隆及表达成功,为进一步研究HoxA10与其它蛋白质的相互作用以及建立HoxA10的荧光素酶报告基因分析系统奠定了基础。     

层粘连蛋白受体基因表达与子宫内膜癌的关系

目的 探讨67ku层粘连蛋白受体(67LR)基因表达与子宫内膜癌的关系。方法 应用免疫组化SABC法检测1990～2001年收治的44例子宫内膜癌、15例子宫内膜增殖症、47例正常子宫内膜组织中67LR的表达;采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法定量检测2000～2001年收治的24例子宫内膜癌、16例子宫内膜增殖症、29例正常子宫内膜新鲜组织67LRmRNA水平。结果 67LR在子宫内膜癌、子宫内膜增殖症的表达较正常子宫内膜均明显增高(P<0.001),但前两组的表达差异无显著性(P>0.05)。高、中分化子宫内膜腺癌67LR表达较低分化者为高(P<0.05);但高、中、低分化组病例67LR mRNA水平差异无显著性(P>0.05)。67LR mRNA水平与免疫组化蛋白表达无明显相关(P>0.05)。结论 67LR蛋白过度表达可能与子宫内膜癌的发生、发展有关。67LR mRNA水平与蛋白表达水平无相关。     

人α1,3-岩藻糖基转移酶VII荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pIRES2-EGFP-FUT7真核表达载体。方法:采用RT-PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶VII(FUT7)全长基因,克隆至pMD18-TSimple载体后,将FUT7亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体并进行鉴定。通过脂质体转染到子宫内膜RL95-2细胞中,荧光显微镜下观察并经RT-PCR检测FUT7的表达。结果:测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT7基因,FUT7基因正确插入pIRES2-EGFP中,在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白在RL95-2细胞中的表达,半定量RT-PCR检测结果显示FUT7的表达明显增加。结论:成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的FUT7真核表达载体,并检测到在RL95-2细胞中的表达,为研究FUT7及其合成的糖抗原sLex在胚胎着床中的作用奠定了基础。     

含编码人精子膜蛋白cDNA的重组沙门氏菌的构建

ＨＳＤ Ｉ是编码人精子膜蛋白（ｈＳＭＰ １）的ｃＤＮＡ,将其中５５０ ｂｐ 的目的ｃＤＮＡ与编码通用终止密码子的Ａｄａｐｔｅｒ相连接,再将该重组ｃＤＮＡ插入到ｐＵＣ１９的多克隆位点,经酶切、测序鉴定后,利用ＥＣｏＲＩ酶切重组质粒,回收插入片段,并将其准确地连接到两种不同拷贝数的ａｓｄ＋ 载体（ｐＹＡ２９２、ｐＹＡ３１３７）中,使其在减毒的Δｃｙａ、Δｃｒｐ、Δａｓｄ 基因缺失的沙门氏菌（χ４５５０）中表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,两种重组沙门氏菌的全细胞裂解液与ｈＳＭＰ １的兔抗血清在２１ ＫＤ处有一明显的结合带。我们成功地构建了表达ＨＳＤＩ（５５０ ｂｐ）的两种重组沙门氏菌,并检测了其体外生长特性。该重组沙门氏菌有望成为一种新的粘膜免疫避孕的疫苗。     

Proto-oncogene erbA expression and increased abundance of progesterone receptors in the mouse uterus after passive immunisation against progesterone before implantation.

Passive immunisation with a monoclonal anti-progesterone antibody (DB3) prevents pregnancy in the mouse, and antibody is localised in the endometrium before the onset of implantation. BALB/c female mice were injected intraperitoneally with 9 nmol of DB3 (a dose known to cause 100% infertility) 32 h post coitum, and the uterus was removed at various times after injection. Using a monoclonal anti-progesterone receptor antibody (PR6), expression of progesterone receptors was found to be abundant in uterine tissue of DB3-treated mice; this was associated with substantial progesterone receptor mRNA levels and with maximum localisation of DB3 antibody as detected by anti-idiotype antibody. Control animals treated with an equal amount of the mouse myeloma protein P3 showed very low levels of progesterone receptor in the uterus. DB3 treatment also affected uterine expression of the proto-oncogene erbA product (which shows primary sequence homology with the progesterone receptor) as revealed by specific antiserum to the ERBA protein and by in situ hybridisation with a cDNA probe to v-erbA. Time-course studies indicated that the erbA gene was expressed at a high level before progesterone receptor expression increased, that its expression was dependent on the presence of the embryo and that erbA expression persisted longer in DB3-treated females. The observations suggest that anti-progesterone immunisation has a direct effect within the uterus, involving persistence of proto-oncogene erbA expression (which itself may represent an early maternal response to pregnancy) and increased progesterone receptor levels resulting from an unopposed oestrogen effect derived from local ligand withdrawal.     

HLA-G短干扰RNA真核表达载体的构建及其在JEG-3细胞株中抑制HLA-G表达的研究

目的:构建HLA-G短干扰RNA表达质粒及探讨HLA-G的功能。方法:根据siRNA设计的原则,结合pSilencer2.1-U6-neo质粒的特点,针对HLA-G基因设计并合成两对寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo,将重组真核表达质粒pSi-lencer2.1-U6-neo-HLA-G采用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、W estern-blot等方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平;MTT法检测转染后JEG-3细胞增殖的变化。结果:RT-PCR和W estern-blot结果均表明瞬时转染重组pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制。结论:pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒构建成功,可下调JEG-3细胞中HLG的表达,抑制绒癌细胞生长。     

携带OPCML基因的慢病毒表达质粒的构建

目的:建立携带和表达OPCML基因的慢病毒(lentiviral viruses,LV)表达质粒。方法:用内切酶将OPCML基因从已构建的表达质粒pcDNA3-OPCML上切下,插入慢病毒载体pWPI-GFP中,构建慢病毒表达质粒pWPI-OPCML,通过酶切、测序和检测验证OPCML蛋白后,将pWPI-OPCML、pCMV-dR8.74和pMDG共转染包装细胞293T,获得重组慢病毒,再感染靶细胞A2780,通过检测标志蛋白-绿色荧光蛋白(GFP)和目的蛋白OPCML进一步验证pWPI-OPCML在细胞中OPCML的表达。结果:(1)pWPI-OPCML中携有正确的OPCML基因,并能在人类细胞中表达;(2)pWPI-OPCML共转染包装细胞293T能产生重组病毒;(3)目的基因OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞A2780,并达到稳定的表达,转导效率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到OPCML和GFP蛋白在靶细胞中的表达。结论:pWPI-OPCML能在人细胞中表达OPCML蛋白,共转染包装细胞获得的重组慢病毒能感染人细胞,作为转基因的工具,具有高效性。