甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的 建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务.方法 对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化.结果 采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性.采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离.结论 甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用.     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

甲3型流行性感冒病毒基因的快速检测

为建立流行性感冒(流感)的快速诊断技术,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测甲3型流感病毒的血凝素(HA)基因.对甲3型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物并进行PCR扩增,比较了它的特异性与灵敏度.结果显示该引物只能扩增甲3型流感病毒的特异性片段,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、流行性腮腺炎病毒无交叉反应.检测的灵敏度1次PCR可达10TCID50/50ml以下,2次PCR反应可达0.1TCID50/50ml以下.采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率,比采用狗肾传代细胞(MDCK)分离病毒的阳性率更高,可达到迅速、正确诊断甲3型流感的实用目的.     

荧光定量PCR法快速检测海南省流感样病例样本的结果与分析

[目的]探讨荧光定量PCR检测方法在海南流感病毒检测中的意义. [方法]随机抽取该省流感监测点流感样病例的咽拭子标本459份和当年1起流感暴发标本共14份,应用荧光定量RT-PCR和常规病毒分离方法进行平行检测. [结果]对于473份流感样病例的咽拭子标本,用荧光定量RT-PCR法检测出阳性结果98份,阳性率20.7%;MDCK细胞培养及病毒分离鉴定出阳性结果46份,阳性率9.7%. [结论]荧光定量RT-PCR方法能在短时间内快速检测流感病毒,并且操作简便、特异性强、灵敏度高.所以荧光定量RT-PCR方法可作为海南省流感样病例的一种快速检测手段,为该省流感疫情的快速检测和疫情处置提供科学的实验室依据.     

应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

目的:对疑似甲型H1N1流感患者标本进行病毒核酸检测确诊,探讨实时荧光定量PCR检测方法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法:采用WHO标准实时荧光定量PCR方法对2009年6月～12月萧山地区采集的436份疑似甲型H1N1流感患者咽拭子标本进行病毒核酸检测,并对甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒和乙型流感病毒进行快速分型。结果:436份咽拭子标本中有144份呈甲型H1N1流感病毒核酸阳性,阳性率33.03%,另检出甲1型流感病毒15份,甲3型流感病毒30份,没有检出乙型流感病毒。结论:实时荧光定量PCR方法操作方便、耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为甲型H1N1流感疫情可靠的快速诊断方法。     

流行性感冒病毒应急检测中缩减荧光定量逆转录-聚合酶链反应时间的实验研究

目的在相同的敏感度与特异性条件下,进一步缩减流行性感冒(流感)病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的时间,为应急检测服务。方法缩短荧光定量RT-PCR经典检测方法中不同反应阶段的时间参数,并与经典方法进行比较,考察改良方法的检测敏感性与特异性。结果用经典方法与缩短某些时间参数的改良方法检测甲3型流感病毒,结果其特异性与灵敏度差异无显著的统计学意义,并可将检测时间缩短1h左右。结论适当缩短经典荧光定量RT-PCR方法中的逆转录、变性以及延伸时间后,灵敏度和特异性无显著影响,这对于突发疫情的应急检测具有实用价值。     

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的：建立用多重逆转录聚合酶链反应（mRT-PCR）检测甲1型、甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道全胞病毒（RSV）A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法，以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况设计。方法：采用经MDCK细胞接种培养的甲3型、乙型流感病毒和Hep-2细胞接种培养的RSV A型、B型标准毒株病毒液，以及甲1型、甲3型、乙型流感病毒和RSV A型、B型混合毒株病毒液，使用5组引物，分别为HA1-5al和Hal-3al（甲1型流感病毒）、HA3-5al和HA3-3al和HA3-3al（甲3型流感病毒）、NP-5b1和NP-3bl（乙型流感病毒）、RSVAF和RSVAR(RSVA型)、RSVBF和RSVBR(RSVB型)，经mRT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果：甲1型、甲3型、乙型流感病毒，RSVA型、B型分别在431，210，390，334，183bp处出现清晰的5条DNA条带。结论：应用5组引物，mRT-PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV，并可对其进行分型，对上呼吸道病毒感染性疾病的诊断和流感的监测方面是非常重要的。     

微流芯片检测流感病毒多重逆转录聚合酶链反应产物的实验研究

[目的 ]　建立应用微流芯片检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)产物的方法 ,在mRT -PCR扩增核酸的基础上自动化灵敏的定量检测扩增产物 ,快速检测甲亚型、乙型流感病毒 ,帮助临床快速诊断和鉴别诊断其他呼吸道病毒感染 ,以及明确流感病毒在人群中感染、流行情况。　 [方法 ]　采用经MDCK细胞分离培养的甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒毒株病毒液 ,使用 3组特异引物经mRT -PCR扩增核酸 ,扩增产物分别采用毛细管电泳技术经Caliper10 0 0微流芯片分析仪自动化检测和经 2 %琼脂糖凝胶电泳法检测。　[结果 ]　设计三组引物对相应甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒靶基因的mRT -PCR扩增产物片段分别为 43 0bp、2 10bp、3 91bp ,本实验mRT -PCR扩增产物经 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,与Marker比照 ,DNA条带基本在此位点附近 ;产物采用毛细管电泳法经Caliper10 0 0微流芯片分析仪后 ,分别于 413bp、2 0 3bp、3 79bp处出现陡峭的峰 ,如图所示。　[结论 ]　应用微流芯片采用毛细管电泳法可对流感病毒mRT -PCR产物进行定位及相对定量 ,有助于快速诊断流感病毒感染 ,有助于对流感的监测。     

双荧光探针实时RT-PCR检测不同样品中甲型H1N1病毒核酸的临床意义

目的采用双荧光探针实时RT-PCR方法检测甲型H1N1流感病毒感染患者不同样品中H1N1病毒核酸,了解其对甲型H1N1流感的快速诊断及病程进展的关系。方法用双荧光探针实时RT-PCR法分别检测118例H1N1患者发病48 h后和（或）恢复期咽拭子、血浆及下呼吸道分泌物中H1N1病毒核酸。结果 118例H1N1患者发病48 h后咽拭子H1N1病毒核酸阳性;57.5%（23/40）重症患者下呼吸道分泌物中H1N1病毒核酸阳性,恢复期3例阳性;37.5%（15/40）重症患者血浆中检测到H1N1病毒核酸。结论双荧光探针实时RT-PCR法可以快速检测H1N1病毒感染,血浆中H1N1病毒核酸阳性可能是重症患者的标志。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测N_2亚型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测甲型流感病毒N2亚型的方法。方法根据N2亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释法检验建立体系的灵敏度并建立相对定量标准曲线;采用N1亚型毒株核酸进行方法特异性检验并对临床疑似流感样病例样本进行检测。结果N2亚型流感病毒的检测灵敏度为2.56×10-6,扩增效率为99.9%,标准曲线r=0.997,特异性为100%。临床ILI样本检测结果与HAI鉴定结果相符。结论本研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N2亚型流感病毒。     

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。     

探讨实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析

目的:探讨实时荧光定量P C R仪器对流感病毒检测效果.方法:选择2019年6月～2020年6月本中心采集的流感病毒咽拭子及血液样本各116份,根据检测方法将其分为三个不同的组别,分别用实时荧光定量P C R仪、普通PCR仪、酶标仪进行检测、最终采用病毒分离培养法进行验证.结果:本次实验研究结果显示,使用实时荧光定量P...     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。     

四重RT—PCR快速检测2013新型H7N9禽流感病毒

目的建立能快速准确检测发热病人咽拭子样本中2013新型H7N9禽流感病毒的四重RT—PCR方法。方法针对甲型流感病毒的M基因设计通用引物,针对2013新型H7N9禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物,选择人源看家基因beta—aetin设计质控引物,通过优化实验条件建立一步法四重RT—PCR反应体系。与商品化实时荧光RT—PCR试剂盒进行方法比对。结果成功建立四重一步法RT—PCR筛查2013新型H7N9禽流感病毒的检测技术。结论该方法简便、实用、成本低廉,适用于2013新型H7N9禽流感病毒的快速检测。