反义RNA抑制synaptotagminⅡ在RBL-2H3的表达及对胞吐的作用

目的：研究SynaptotagminⅡ（简称syt2）在RBL-2H3（简称RBL）中的表达及其在胞吐中的作用。方法：通过Westernblot检测Syt2在RBL中的表达情况。用高保真酶扩增Syt2，与pEGFP-N1构建全长反义基因表达载体，电穿孔转染RBL，G418筛选获得稳定转染细胞。通过钙离子载体和抗原刺激，应用Westernblot检测稳定转染细胞和对照细胞分泌的组织蛋白酶D，分析Syl2对胞吐的影响。结果：在RBL中检测到Syt2表达。构建了pEGFP-N1-Syt2-AS质粒，插入片段测序结果与GenBank登录号NM012665（ratsyt2）序列完全一致。经转染和G418筛选，获得了稳定转染细胞RBL-Syt2-AS，Westernblot结果显示，两株RBL-Syt2-AS表达的syt2均明显减少，分别只有对照的8％和10％。经刺激后，RBL-Syt2．AS分泌的组织蛋白酶D较对照明显增加。结论：Syt在RBL中表达，其对RBL溶酶体胞吐起负调控作用。     

FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响

目的：观察FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响。方法：RT-PCR法扩增大鼠FasL穿膜区和胞外区cDNA，成功构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3，RT-PCR、免疫印迹法鉴定FasL在RBL-2H3上的表达，Annexinv流式细胞检测pcDNA3．1／FasL转染RBL-2H3后细胞的凋亡情况。结果：获得FasL穿膜区和胞外区eDNA，构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3后在细胞膜和上清均有FasL的存在，瞬时转染RBL-2H3后48小时，细胞发生凋亡。结论：吧大细胞可以通过Fas-FasL途径凋亡，为FasL基因应用于过敏性疾病的治疗提供依据。     

丹参酮对RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响

研究丹参酮对肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响,深入探讨丹参酮的抗炎药理机制。应用细胞培养、流式细胞术等方法,观察丹参酮等药物对体外培养的RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响。结果:丹参酮I、IIA对肥大细胞增殖有明显的抑制作用,其IC50约为20μmol/L,并能明显促进细胞凋亡,且对RBL-2H3细胞活化脱颗粒有较强的抑制作用。结论:丹参酮对肥大细胞功能具有明显的抑制作用,可能是其发挥抗炎作用的一个重要方面。     

银杏叶提取物对双酚A活化RBL-2H3细胞株表达IL-4和TNF-α的影响

探讨银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba,EGB)对于双酚A(Bisphenol A,BPA)活化RBL-2H3(简称:RBL)表达IL-4和TNF-α的影响。利用BPA激活RBL,通过测定β-氨基已糖苷酶和RT-PCR,研究EGB对于活化RBL脱颗粒以及表达IL-4和TNF-α的影响。结果显示,经BPA活化的RBL,加入EGB(浓度为160μg/ml)后,其β-氨基已糖苷酶释放仅为对照的45%,其IL-4mRNA表达量降低到对照的33.5%,TNF-αmRNA表达量降低到对照的26.8%。结果说明EGB极大地抑制了活化RBL的脱颗粒,同时对于活化RBL表达IL-4和TNF-α也具有极大的抑制作用,提示EGB治疗哮喘的作用与其抑制肥大细胞表达IL-4和TNF-α有关。     

银杏叶提取物对于BPA活化RBL-2H3分泌IL-13的影响

目的:探讨银杏叶提取物(Extract of Ginkgo biloba,以下简称EGB)对于BPA(Bisphenol A,双酚A)活化RBL-2H3(简称RBL)分泌白细胞介素13(IL-13)和蛋白激酶C(PKC)活化的影响.方法:利用BPA激活RBL,通过测定β-氨基己糖苷酶了解活化RBL脱颗粒情况,利用ELISA测定IL-13,Western blot检测RBL胞膜与胞浆PKC比值了解PKC活化情况.结果:经BPA活化后,RBL释放的β-氨基己糖苷酶上升到41.6％,IL-13分泌量上升到95.4 pg/ml,加入EGB(浓度为160μg/ml)后,RBL释放的β-氨基己糖苷酶降低到18.7％,分泌的IL-13降低到45.3 pg/ml,同时PKC活化也受到了明显的抑制.结论:EGB通过抑制RBL细胞的PKC活化,进而抑制活化RBL脱颗粒和IL-13分泌,提示EGB治疗哮喘的作用可能与其抑制肥大细胞PKC活化和分泌IL-13有关.     

青藤碱对RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响

目的 通过研究青藤碱对肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响,深入探讨青藤碱的抗炎作用机理.方法 应用细胞培养,流式细胞术等方法,观察青藤碱等药物对体外培养的RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响.结果 青藤碱对肥大细胞增殖有明显的抑制作用,其IG50约为1 mmol/L,并能促进肥大细胞凋亡,且对RBL-2H3肥大细胞活化脱颗粒有较强的抑制作用.结论青藤碱可能部分通过下调肥大细胞功能发挥抗炎抗风湿作用.     

绿色荧光蛋白与H—2K^b融合基因的构建及表达

目的 构建ＧＦＰ与Ｈ－２Ｋ＾ｂ融合基因，并分析融合基因的活细胞中的表达。方法 应用基因工程技术构建Ｈ－２Ｋ＾ｂ与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的融合基因。ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析基因表达；激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结果ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明融合基因获得了正确表达。激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明，Ｋ＾ｂ－ＧＦＰ融合分子象天然Ｋ＾ｂ分子一样表达在细胞膜表面，且     

人颗粒酶B融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用

目的 观察颗粒酶B（granzyme B)融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用。方法 用RT－PCR法获取人granzyme B全长cDNA，经重组PCR将活性型序列的5′端与一段PE转膜肽序列融合。将所获重组基因克隆入绿色荧光蛋白（GFP）共表达载体pIRES2-EGFP,转染HeLa细胞。用免疫组化染色法检测目的蛋白的表达，荧光显微镜和电镜观察转染细胞的形态和结构。结果 成功地获得了野生型granzyme B cDNA及其融合蛋白基因，并构建了融合蛋白基因与GFP基因共表达的真核载体。转染HeLa细胞后，检测到目的蛋白的表达。荧光显微镜观察转染细胞有两种变化：一种表现为体积增大并常伴随多核现象；另一种出现细胞质和细胞核的固缩。电镜观察显示，多核巨细胞生长状态良好，固缩的小细胞则呈现凋亡的典型特征。结论 granzyme B融合蛋白在HeLa细胞中异位表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现多核的大细胞和核固缩的小细胞。     

人线粒体融合蛋白-2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2, MFN2)基因真核表达载体并对其进行鉴定。方法在pEGFP-N1载体多克隆位点插入人MFN2基因编码区序列,酶切、测序验证是否插入及正确性。将所构建载体转染原代培养的人血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cel s,VSMCs),荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达;荧光定量PCR和Western blot分别检测MFN2的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了人MFN2基因真核表达载体,其转染VSMCs后,可以检测到MFN2 mRNA及蛋白水平高表达(<0.01)。结论成功构建了人MFN2基因真核表达载体,且能够在原代VSMC中过表达。     

大鼠Deltal基因转染对树突状细胞生物学特性的影响

目的:探讨大鼠deltal基因在树突状细胞(DCs)中的表达及其意义.方法:利用脂质体基因转染技术,将含大鼠deltal基因片段的真核表达载体peDNA3.1(+)/deltal转染入DCs中,采用流式细胞术(FCM)和混合淋巴细胞培养(MLR)等方法检测deltal基因转染对DCs生物学特性的影响.结果:比较实验组、空载体组和对照组DCs在超微结构、细胞周期和细胞生长速度上无明显差异.FCM检测显示,deltal并不影响DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHC-H类分子lad的表达;但deltal基因转染的DCs分泌IL-12的水平明显降低(P<0.05),即使加入LPS刺激后,IL-12的分泌也无明显增加.结论:Deitai/Notch信号表达的增加,不影响DCs的分化与成熟,对其免疫学功能起负性调节作用.Deltal的可能机制为其通过抑制DCs分泌IL-12,来促使Th1/Th2细胞亚群的分化倾向于Th2细胞方向.     

大鼠重组IgE Fc区CH2-3的原核表达及活性研究

目的 研究大鼠IgE的Fc区CH2-3的生物学活性。方法 构建大鼠IgE的Fc区CH2-3的原核表达质粒pBAD／gⅢA／Ch2-3，并转化入TOP10中，阿拉伯糖诱导表达、周质腔抽提、Ni-NTA金属鳌合柱纯化获得大鼠IgE的Fc区CH2-3，细胞及动物水平检测蛋白质生物学活性。结果 原核系统表达出大鼠IgE的Fc区CH2-3，它能够阻断OVA激发的RBL-2H3的脱颗粒反应，阻断被动皮肤实验。结论 大鼠IgE的Fc区CH2-3能够封闭IgE高亲和力受体，阻断过敏反应。     

大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。     

Inhibitory effect of interleukin-2 on histamine release from rat mast cells

Interleukin-2 (IL-2) inhibited histamine release from rat mast cells induced by compound 48/80 in a concentration-dependent manner. The inhibitory effect of IL-2 on histamine release was also dependent on the length of the incubation period; the maximum inhibition was achieved at 8 h after IL-2 addition. Furthermore, IL-2 inhibited not only IP₃ production but also⁴⁵Ca uptake in mast cells stimulated by compound 48/80. Since IL-2 enhanced [³H]-leucine uptake into mast cells, this suggests that protein synthesis may be related in some way with the inhibition of histamine release. IL-2 treatment augmented the synthesis of a protein having a molecular weight of approximately 35 kDa. From Western blotting analysis, it became clear that the production of lipocortin-I was augmented in rat mast cells by IL-2 treatment. The present study shows that IL-2 induces the synthesis of lipocortin-I in mast cells and that lipocortin-I may play some role in inhibiting histamine release from mast cells.     

Inhibitory effect of interleukin-2 on histamine release from rat mast cells

Interleukin-2 (IL-2) inhibited histamine release from rat mast cells induced by compound 48/80 in a concentration-dependent manner. The inhibitory effect of IL-2 on histamine release was also dependent on the length of the incubation period; the maximum inhibition was achieved at 8 h after IL-2 addition. Furthermore, IL-2 inhibited not only IP₃ production but also⁴⁵Ca uptake in mast cells stimulated by compound 48/80. Since IL-2 enhanced [³H]-leucine uptake into mast cells, this suggests that protein synthesis may be related in some way with the inhibition of histamine release. IL-2 treatment augmented the synthesis of a protein having a molecular weight of approximately 35 kDa. From Western blotting analysis, it became clear that the production of lipocortin-I was augmented in rat mast cells by IL-2 treatment. The present study shows that IL-2 induces the synthesis of lipocortin-I in mast cells and that lipocortin-I may play some role in inhibiting histamine release from mast cells.     

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

背景：基因治疗已成为疾病治疗的新趋势,为某些难治性疾病带来了曙光,合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。 目的：探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。 方法：从SD大鼠骨髓分离、培养、鉴定内皮祖细胞,采用构建的慢病毒载体(LV)将空载体(LV-eGFP)或骨形态发生蛋白2基因(LV-eGFP-BMP2)转染至内皮祖细胞,通过eGFP荧光检测转染效率。ELISA法检测上清液中骨形态发生蛋白2蛋白的分泌,Western blot法检测细胞骨形态发生蛋白2蛋白的表达,比较转染后细胞的迁移、增殖和抗凋亡能力。 结果与结论：慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体的转染效率可达90%。与正常内皮祖细胞、转染空载体内皮祖细胞比较,转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白增加(P < 0.01),迁移和增殖能力无明显改变(P > 0.05),肿瘤坏死因子α损伤后的细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。结果表明慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体可成功转染内皮祖细胞,转染后可增加内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白,增强对炎性损伤的抗凋亡能力,对迁移能力和增殖活性无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

The effect of captopril on histamine release from purified rat mast cells

OBJECTIVE: Captopril as inhibitor of angiotensin-converting enzyme is widely used in cardiovascular therapy, however, in some patients this drug causes allergic side effects. This fact suggests that captopril may release histamine from mast cells. MATERIALS AND METHODS: Peritoneal mast cells were obtained from rats. The cells were purified by Percoll. Aliquots of mast cells were incubated with captopril or with vehicle. Histamine was determined by the spectrofluorimetric assay. RESULTS: The results were analyzed with the Kruskall-Wallis (ANOVA) test. The study has shown that captopril releases histamine from mast cells. The process depends on Ca2+ presence in the incubation environment. Sodium cromoglycate, as mast cell membrane stabilizer, inhibits the effect of captopril. CONCLUSIONS: Our results suggest that allergic side effects of captopril may be linked to histamine release from mast cells.     

The effect of tartrazine on histamine release from rat peritoneal mast cells

The release of histamine from purified rat peritoneal mast cells induced by specific antigen (egg albumin), compound 48/80 and calcium ionophore A23187 was modified by tartrazine. Histamine release induced by 48/80 and antigen was inhibited by the presence of 10⁻⁵ to 10⁻²M tartrazine. The inhibitory effect on egg albumin induced histamine release was maximal when the tartrazine was added simultaneously with egg albumin, and was reduced by increased preincubation of the cells with tartrazine. Tartrazine had a small inhibitory effect on ionophore induced release at high concentrations, but augmented histamine release at tartrazine concentrations of 10⁻³ and 10⁻⁴M. Augmentation of ionophore induced release was maximal at between 0–5 min preincubation of the cells with tartrazine.     

TIMP-3基因转染抑制人肺癌细胞系侵袭与转移的研究

目的探讨金属蛋白酶组织抑制因子３（ＴＩＭＰ３）对高转移性人肺巨细胞癌细胞系（ＢＥ１）恶性表型的影响。方法构建含全长人ＴＩＭＰ３ｃＤＮＡ的真核表达载体,用脂质体法转入ＢＥ１细胞。检测转染后ＢＥ１细胞的体外侵袭及裸鼠体内成瘤性及转移能力的变化。结果ＢＥ１细胞在转入ＴＩＭＰ３ｃＤＮＡ后表达ＴＩＭＰ３ｍＲＮＡ,与母系及空载体对照相比,体外侵袭力降低,在裸鼠体内成瘤率降低（对照组６／６只,实验组９／１２只）,成瘤潜伏期延长,转移至肺和淋巴结的能力降低（对照组分别为５／６只和６／６只;实验组分别为１／１２只和５／１２只）。结论特异性上调ＴＩＭＰ３基因的表达可在一定程度上逆转ＢＥ１细胞的恶性表型