曲安奈德对色素上皮细胞衍生因子表达的影响

目的 观察曲安奈德(TA)对人视网膜色素上皮细胞衍生因子(PEDF)表达的影响.方法 体外培养人视网膜色素上皮(RPE)细胞,取第4～6代细胞用于实验.分别以浓度为40、400、4×103、4×104μg/L的TA干预12、24、48 h后,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测培养液及细胞浆中PEDF蛋白表达水平.采用20 ng/ml的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)预干预RPE细胞24 h后,再加入400μg/L的TA进行干预(TNF-α预处理组);分别选用20 ng/ml的TNF-α和400μg/L的TA单独干预RPE细胞作为单独干预组.分别作用1、6、24 h后,测定3组细胞培养液及细胞浆中PEDF及细胞浆中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)的蛋白表达水平.结果 各TA浓度组RPE细胞培养液及细胞浆中PEDF蛋白表达均升高,其中400μg/L组PEDF蛋白表达最高(P＜0.05).干预1、6、24 h时,TNF-α预处理组和TA单独干预组PEDF蛋白表达均增高、p-p38MAPK蛋白表达均降低(P＜0.01);TNF-α单独干预组PEDF蛋白表达降低、p-p38MAPK蛋白表达增高(P＜0.01).结论 TA能够上调体外培养的人RPE细胞PEDF蛋白表达,下调p-p38MAPK蛋白表达.     

白细胞介素-1β促人视网膜色素上皮细胞分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的研究

目的 观察炎前因子白细胞介素-1β(IL-1β)对培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响.方法 采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定IL-β浓度为0、1、10、20 ng/ml和时间为24、36、48 h作用下RPE细胞的VEGF和bFGF分泌量变化;采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定10 ng/ml IL-1β作用48 h后RPE细胞的VEGF和bFGFmRNA变化;噻唑蓝(MTT)比色法测定IL-1β刺激后RPE细胞的增生状态.结果 相同刺激时间即36 h作用下,终浓度为1、10 ng/ml的IL-1β促进RPE细胞VEGF的分泌(q=32.79,42.56;P<0.01);10 ng/ml的IL-1β促进bFGF的分泌(q=7.514,P<0.01);与浓度为10 ng/ml的IL-1β刺激相比,增加IL-1β刺激浓度至20 ng/ml使RPE细胞VEGF和bFGF分泌量下降(q=9.35,6.92;P<0.01).相同浓度即10 ng/ml的IL-1β作用下,IL-1β作用时间与RPE细胞VEGF和bFGF分泌量具有正性时间-效应关系;浓度为10 ng/ml的IL-1β作用48 h可促进RPE细胞的VEGF和bFGF mRNA水平;MTT结果 证明IL-1β未明显影响RPE细胞的增生状态(F=0.317,P>0.05).结论炎前因子IL-1β可影响人RPE细胞VEGF和bFGF的分泌量,在一定的作用浓度和作用时间范围内具有显著的促进效应.     

TNF-α通过刺激RF/6A细胞表达SDF-1促进血管生成

目的 研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对体外培养的猴脉络膜/视网膜内皮细胞(RF/6A)表达基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及细胞增殖、迁移和管腔形成的影响,探讨TNF-α参与视网膜血管形成的初步机制.方法 取体外培养的生长良好的RF/6A细胞用于实验,将细胞随机分为对照组、不同浓度TNF-α组(1、10、100 ng/ml)、TNF-α+AMD3100组(SDF-1拮抗剂AMD3100预处理1h,培养液中最终浓度为1μg/ml,然后加入TNF-α).培养24h、48h后采用ELISA法检测细胞上清液中SDF-1含量,MTT法检测细胞增殖,细胞划痕法检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测管腔形成.结果 ①TNF-α(1 ng/ml)作用24和48 h,RF/6A的SDF-1表达量与对照组无明显差异;TNF-α(10、100ng/ml)作用后两个时间点SDF-1表达量均明显高于对照组(P＜0.01);TNF-α (10 ng/nl)+AMD3100组SDF-1表达量较TNF-α (10 ng/ml)组明显减少(P＜0.05).②TNF-α不同浓度作用24 h的细胞相对增殖率均高于对照组(P＜0.05),且随着TNF-α浓度的升高而增加;除1 ng/ml浓度组外,TNF-α各组作用48h的相对增殖率均较对照组升高(P＜0.05);TNF-α(10 ng/ml)+AMD3100组的细胞相对增殖率在24h和48h时均明显小于TNF-α(10 ng/ml)组(P＜0.05).③TNF-α (10 ng/ml)组RF/6A细胞24h的迁移距离明显大于对照组(P＜0.05),TNF-α (10ng/ml)+AMD3100组迁移距离较TNF-α(10ng/nl)组减小(P＜0.05);培养48h后,各组之间的差异与24h的结果类似(P＜0.05).④TNF-α (10 ng/ml)组管腔形成数明显多于对照组(P ＜0.01),TNF-α (10ng/ml)+ AMD3100组明显少于TNF-α(10 ng/ml)组(P＜0.01).结论 TNF-α能够促进RF/6A细胞表达SDF-1,诱导细胞增殖、迁移和管腔形成,拮抗SDF-1的作用可明显抑制TNF-α诱导的血管生成.提示TNF-α促进RF/6A细胞的血管生成过程可能是通过刺激细胞产生SDF-1实现的.     

细胞因子对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1表达的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞syndecan-1表达的影响，并探讨其作用的信号转导途径。 方法 体外培养人RPE细胞，采用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光法检测正常细胞syndecan-1 mRNA、蛋白的表达；免疫荧光法定性、定量观察不同刺激因子作用下syndecan-1的表达变化，包括：7、35 ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激24 h，1、6 μg/ml脂多糖（LPS）刺激11 h, 7 ng/ml TNF-α刺激不同时间（0～24 h，每2 h为1个时间点，共13个时间点)，30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液刺激3、14、43 h；细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路特异性阻断剂PD098059预处理2 h后对30% THP-1细胞上清液作用的调节；30% THP-1细胞上清液刺激细胞3 h后0.25%胰酶作用5 min，噻唑蓝法检测细胞贴壁情况。 结果 在正常RPE细胞中可检测到syndecan-1 mRNA和蛋白的表达；未受刺激的RPE细胞细胞膜、细胞浆及核仁呈强的黄绿色荧光，细胞核呈浅绿色荧光；随TNF-α、LPS浓度及时间增加，荧光强度呈减弱趋势(P<0.01); 30% THP-1细胞上清液刺激后细胞荧光强度明显减弱(P<0.001)。50 μmol/L PD098059预处理2 h后可部分阻断30% THP-1细胞上清液的下调作用。与对照组相比，THP-1细胞上清液作用3 h后贴壁细胞数下降（P<0.05）。 结论 TNF-α和LPS可下调体外培养的人RPE细胞syndecan-1的表达；30% THP-1细胞上清液可下调RPE细胞syndecan-1的表达、促使细胞脱壁，且该作用至少通过了ERK 1/2信号转导通路。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 113-116)     

表皮生长因子诱导人视网膜色素上皮细胞整合素α5表达对细胞增生和迁移的影响

目的 观察表皮生长因子(EGF)诱导人视网膜色素上皮(RPE)细胞整合素α5表达对细胞增生和迁移的影响.方法 在0.1、1.0、10.0、20.0、100.0 ng/ml EGF浓度条件下,体外培养人RPE细胞.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及流式细胞术观察不同浓度组整合素α5mRNA和蛋白的表达.后将实验分为Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/F12、DMEM/F12+10.0 ng/ml EGF、DMEM/F12+10.0ng/ml EGF+兔抗人整合素α5多克隆抗体(1:100)及DMEM/F12+10.0 ng/ml EGF+兔抗人波形蛋白抗体(1:100)组,采用噻唑蓝(MTT)比色法和Boyden小室法检测细胞增生及迁移.结果 RT-PCR检测显示,细胞培养12 h,EGF对人RPE细胞整合素α5mRNA合成无明显影响(F-0.618,p=0.687);细胞培养24、48 h,EGF能刺激人RPE细胞合成整合素α5mRNA,并呈浓度依赖性(F=465.303,212.340;P=0.000,0.000).流式细胞术检测显示,10.0 ng/ml组整合素α5荧光强度最强,与空白对照组和0.1 ng/ml组比较,差异有统计学意义(P<0.01).MTT比色法和Boyden小室法检测显示,整合素α5的表达促进人RPE细胞增生和迁移.结论 EGF促进整合素α5mRNA和蛋白的表达,整合素α5的表达促进人RPE细胞增生和迁移.     

内皮素刺激下人RPE细胞的自分泌调节

目的检测内皮素（endothelin-1，ET-1）刺激人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞后ET-1的自分泌。方法用体外培养的RPE细胞，经10^-11 mol· L^-1 ,10^-9 mol· L^-1、10^-7 mol· L^-1作用后，用免疫组织化学和原位杂交检测RPE细胞ET-l的表达和一氧化氮舍酶l（nitric oxide synthase1，NOS1）的表达，并用LeicaQ750图像分析仪定量分析表达量；用放射免疫测定检测细胞调理液中ET-1和6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）含量。结果在未经ET-1．作用的RPE中ET—1、ET-1mRNA和NOS1仅见少量细胞微弱表达，3个浓度ET-1作用24h后，图像分析在不同浓度ET-1刺激后均检测出ET-1的表达增强，并有浓度依赖性（F=9．511，P〈0．01），NOS1的表达也增强（F=16．113，P〈0．01），两者有直线相关性（r=0．685，P〈0．05）。在调理液的检测中，ET—1和6-Keto-PGF1α的含量均随着ET-1作用浓度的增加而增加，各作用浓度两者含量均有统计学差异（前者F=23．67，P〈0．01；后者F=44．431，P〈0．01）；并且两者有直线相关性（r=0．85，P〈0．01）。结论ET—1刺激RPE细胞表达并分泌ET-1，同时伴随的NOS1表达增加和6-Keto-PGF1α分泌增加可能是针对ET-1的负向调节作用。[眼科新进展 2007；27（3）：161-164]     

氧化损伤对体外培养人视网膜色素上皮细胞PEDF的影响

目的研究氧化损伤对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞表达色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)的影响。方法体外培养人RPE细胞,加入浓度为600μmol.L-1H2O2分别作用不同时间(2h、8h、24h),采用免疫细胞化学法检测PEDF蛋白的表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测PEDF mRNA。结果免疫细胞化学染色对照组即有PEDF的阳性表达,而氧化损伤2h、8h、24h PEDF蛋白阳性表达量逐渐减少,染色由棕黄色变为黄色。各时间段两组结果比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测PEDF mRNA量与PEDF蛋白表达变化一致。结论氧化损伤能促使人RPE细胞PEDF表达下调,并在一定范围内与作用时间有关。     

shRNA抑制人RPE细胞HIF-1 α基因表达对VEGF及PEDF表达的影响

目的利用小发卡环RNA（shRNA）使缺氧培养条件下的人视网膜色素上皮（RPE）细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因沉默，观察对血管内皮生长因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的影响。方法体外转录法合成对HIF-1αmRNA序列的两个靶点的shRNA，对缺氧（150μmol／LCoCl2模拟）培养条件下人RPE细胞的HIF-1α进行干扰，使用RT—PCR检测HIF-1α、VEGF和PEDFmRNA的表达及Western印迹分析检测HIF-1α、VEGF和PEDF蛋白水平。结果HIF-1αmRNA的两种shRNA均能有效地抑制RPE细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达，同时也有效地抑制VEGFmRNA和蛋白表达，并促进PEDF蛋白表达，但对PEDFmRNA的表达无影响。结论HIF-1αmRNA的shRNA能有效地使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默，进而有效地抑制缺氧对VEGF的上调作用，同时也促进PEDF表达。揭示了HIF-1与缺氧条件下PEDF翻译后的下调机制有关，是促进视网膜新生血管形成最为关键的细胞因子之一。     

瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的 观察瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化损伤的影响。方法 体外培养的人RPE细胞随机分为正常对照组和胰岛素抵抗组。分别加入 0、10、100 ng/ml瘦素干预24、48、72 h。2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧（ROS）的产生情况;免疫细胞化学法检测细胞内8-羟基-2′-脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）的表达量;蛋白质免疫印迹法检测细胞浆中8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGGl）的表达量。结果 干预后24、48、72 h,正常对照组、胰岛素抵抗组RPE细胞ROS（正常对照组：F=37.136、37.178、49.634;胰岛素抵抗组：F=9.822、28.881、71.150）、8-OHdG表达量（正常对照组：F=88.643、390.920、1039.276;胰岛素抵抗组：F=273.311、299.155、82.237）均随瘦素浓度增加而增加,hOGGl的表达量（正常对照组：F=470.062、1073.113、295.456;胰岛素抵抗组：F=240.032、592.389、527.760）随瘦素浓度的增加而递增,差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组、胰岛素抵抗组在相同浓度瘦素干预下,随干预时间延长,胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量呈现高于正常对照组的趋势。干预后24 h,胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量与正常对照组比较,差异无统计学意义（F=23.392,P＞0.05）;干预后72 h,胰岛素抵抗组PRE细胞hOGGl表达量低于正常对照组,差异有统计学意义（F=129.394,P＜0.05）。在相同浓度瘦素干预下,随干预时间延长,RPE细胞hOGG1表达量呈现先升高后降低的趋势。干预后48 h,正常对照组（F=83.673、268.000、373.492）、胰岛素抵抗组（F=49.021、304.293、294.293）RPE细胞hOGGl表达量均高于干预后24、72 h RPE细胞hOGGl表达量,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 正常状态及胰岛素抵抗状态下瘦素能引起人RPE细胞氧化损伤,随着瘦素浓度的增加、作用时间的延长氧化损伤的程度呈加重趋势;氧化损伤的修复随着时间的延长呈先强后弱的趋势,随着瘦素浓度的增加而呈增强的趋势。     

verteporfin光动力疗法对体外培养的成人视网膜色素上皮细胞色素上皮衍生因子、血管内皮生长因子表达水平的影响

目的 观察经光敏剂verteporfin光动力疗法（PDT）处理后的体外培养的成人视网膜色素上皮（RPE）细胞色素上皮衍生因子（PEDF）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平的改变。 方法 采用噻唑蓝比色法（MTT）测定PDT前后体外培养的成人RPE细胞活性的变化。应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定PDT前后RPE细胞PEDF和VEGF mRNA表达水平的变化。 结果 PDT可造成RPE细胞死亡，死亡率与激光能量密度和光敏剂浓度成正相关。PDT后RPE细胞表达PEDF、VEGF mRNA水平下降，下降程度与激光能量密度和光敏剂浓度成正相关。 结论 PDT可下调体外培养的成人RPE细胞PEDF、VEGF mRNA的表达水平，这可能与PDT治疗黄斑下脉络膜新生血管膜（CNVM）后CNVM的消退或再生有关。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 256-260)     

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的　观察色素上皮衍生因子（PEDF）对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响。方法　将Sprague-Dawley大鼠分为模型组、模型对照组、PEDF干预组（干预组）、干预对照组,每组均为8只大鼠。模型组、干预组、干预对照组大鼠链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠,干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 10 μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液。采用免疫组织化学法和实时荧光聚合酶链反应（PCR）法检测视网膜GS和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达变化。将视网膜Müller细胞置于高糖环境下培养,实验干预组中加入100 ng/ml PEDF,空白对照组加入相同容积的培养液,24 h后通过蛋白质免疫印迹（Western blot）法和实时荧光PCR法检测PEDF对Müller细胞GS和IL-1β表达的改变。流式细胞仪锚定蛋白-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶（Annexin V-FITC-PI）双染色法检测100ng/mlPEDF对高糖状态下Müller细胞凋亡的影响。结果　实时荧光PCR法从基因水平和免疫组织化学法从蛋白质水平检测均显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GS表达降低,而IL-1β的表达升高,实时荧光PCR法：GS: t=4.23, P＜0.01;IL-1β: t=16.73,P＜0.01;免疫组织化学法：GS:t=5.13,P＜0.01;IL-1β: t=9.32, P＜0.01;干预组大鼠玻璃体腔注射PEDF 48 h后,IL-1β的表达下降,GS的表达升高,与干预对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=3.87,P＜0.01;IL-1β: t=3.61,P＜0.05;免疫组织化学法：GS:t=3.32, P＜0.05;IL-1β: t=2.63, P＜0.05。在高糖环境下,通过实时荧光PCR法和Western bot 法检测均显示PEDF可以下调IL-1β的表达,而上调GS的表达,与空白对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=2.89, P＜0.05;IL-1β: t=3.37, P＜0.05;Western blot：GS: t=2.66, P＜0.05;IL-1β: t=3.23, P＜0.05。流式细胞仪检测结果显示,PEDF可以抑制高糖环境下Müller细胞的凋亡,实验组凋亡率与空白对照组凋亡率比较,差异有统计学意义(t=3.21,P＜0.05)。结论　对于糖尿病大鼠,PEDF可能通过下调视网膜Müller细胞中IL-1β的表达来上调GS的表达,从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡      

金黄色葡萄球菌培养上清液对中性粒细胞及RPE细胞炎性相关因子表达的影响

目的 观察金黄色葡萄球菌培养上清液对中性粒细胞及视网膜色素上皮细胞(RPE)炎性相关因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的变化.方法 实验研究.分离入外周血中性粒细胞,与人RPE细胞株D407共培养,加入无菌体的金黄色葡萄球菌ATCC29213培养上清液.其中细菌上清液分为50μl、100μl、250μl、500μl以及空白组、脑心浸萃液态培养基对照组6组;中性粒细胞数量分为空白组、1 ×104、5 ×104、5×105,4组.在6、12、24、48、72 h等时间点搜集培养液上清,应用酶联免疫吸附试验检测培养液中IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的变化.结果 当不同剂量金黄色葡萄球菌上清液单独作用RPE细胞时,培养液中IL-1β水平随着细菌上清液剂量增加而上升、亦随着作用时间的延长而增加;但IL-6水平500μl组高于空白组,仅在24h[(23.17±3.16)ng/L;(7.61±1.53) ng/L]及48 h[ (35.00 ±4.37) ng/L;(13.17±3.27)ng/L]时差异具有统计学意义(P =0.001;P =0.026).RPE细胞在100μl细菌上清液作用下,加入不同数量中性粒细胞共培养,5×105组培养液中IL-1β水平在6 h[ (236.62±8.20) ng/L]及12 h[ (447.42±35.13)ng/L]均高于其余各组,差异具有统计学意义(6 h:P =0.000,P=0.000,P=0.002;12 h:P =0.000,P=0.000,P=0.000);培养液中IL-6的水平在12 h时5×105组[( 46.96±2.72) ng/L]亦高于其余各组,差异具有统计学意义(P =0.000,P=0.000,P=0.000).在各时间点培养液中均检测不到明显的TNF-α表达.结论 中性粒细胞及RPE细胞共培养体系在金黄色葡萄球菌上清液的刺激下可检测到IL-1β和IL-6表达;其中IL-1β表达在早期出现,且高水平状态维持较长.金黄色葡萄球菌的毒力因子含量及中性粒细胞数量对引发IL-1β和IL-6的高表达起重要作用.     

二甲双胍对炎症状态下人视网膜血管内皮细胞生物学行为的保护作用及其机制

背景 研究表明炎性过程参与糖尿病视网膜病变(DR)的发生和发展,而炎症作用的靶细胞为视网膜血管内皮细胞(RVECs).二甲双胍是临床上常用的降血糖药物,近年来表明其可发挥保护心血管、预防肿瘤和保护血-脑屏障等多重生物学效应,但其对炎症状态诱导的人视网膜血管系统异常是否具有防护作用尚不清楚. 目的 观察二甲双胍对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激下人视网膜血管内皮细胞(RVECs)增生、移行以及分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-8(IL-8)的影响,探讨二甲双胍对炎症环境中人RVECs生物学行为的保护作用. 方法 对原代RVECs进行培养和传代并分为正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α(2.5 ng/ml)组、TNF-α+不同浓度(5、10、20、40 mmol/L)二甲双胍组,分别按照分组方法在培养液中添加相应药物处理24 h.分别于处理前及处理后24 h采用Image-Pro Plus Software 7.0软件计数各组细胞数目;采用MTS法检测各组RVECs的吸光度(A490)值以评价细胞的代谢活力;采用Transwell小室法检测各组迁移细胞数;采用ELISA法检测各组细胞上清液中MCP-1和IL-8质量浓度,并对各组间检测结果进行比较. 结果 正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α组、TNF-α+5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α +20 mmol/L二甲双胍组和TNF-α+40 mmol/L二甲双胍组细胞数目总体比较差异有统计学意义(F=189.31,P＜0.01);各组细胞代谢活力(A490值)分别为0.32+0.02、0.32±0.03、0.97±0.02、0.90土0.05、0.76±0.15、0.74±0.05和0.41±0.03;各组细胞移行数目分别为(1 214±49)、(1 200±45)、(1 648±43)、(1 309±48)、(1 279±73)、(961±60)和(942±106)/视野;各组细胞上清液中MCP-1质量浓度分别为(0.385±0.050)、(0.362±0.060)、(2.285±0.200)、(1.131±0.180)、(0.622±0.120)、(0.537±0.090)和(0.492±0.130) μg/ml,IL-8质量浓度分别为(0.385±0.080)、(0.390±0.120)、(1.123±0.130)、(0.899±0.180)、(0.680+0.060)、(0.417±0.090)和(0.335±0.100) μg/ml,组间A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度的总体比较差异均有统计学意义差异(F=73.31、103.89、150.92、268.32,均P＜0.01),TNF-α组细胞数目、4490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显高于正常对照组,TNF-α+ 10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+20 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+40 mmol/L二甲双胍组细胞数目、A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显低于TNF-α组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 二甲双胍对TNF-α诱导的人RVECs增生、移行及分泌MCP-1、IL-8的能力均有抑制作用,从而可能对炎症环境中的RVECs发挥保护作用.     

Cell-Associated Human Retinal Pigment Epithelium Interleukin-8 and Monocyte Chemotactic Protein-1: Immunochemical and In-situ Hybridization Analyses

Human retinal pigment epithelial (RPE) cells secrete chemokines, interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in response to pro-inflammatory cytokines. In this study we (1) examined the efficiency of human RPE IL-8 and MCP-1 secretion, (2) determined the amount of neutrophil and monocyte chemotactic activity in human RPE cell conditioned media and cell extracts that is attributable to IL-8 and MCP-1, respectively, and (3) assessed the sensitivity of immunohistochemistry and in situ hybridization for detecting chemokine production by cytokine-stimulated human RPE cells. Conditioned media and extracts from human RPE cells stimulated with various physiologic concentrations of interleukin-1 beta (IL-1β) (0.2–20 ng ml⁻¹), tumor necrosis factor (TNF-α) (0.2–20 ng ml⁻¹) or interferon-gamma (IFN-γ) (10–1000 U ml⁻¹) were examined to compare secreted and cell associated levels of IL-8 and MCP-1 at various time points up to 24 hr.ELISA demonstrated that IL-8 and MCP-1 are both efficiently secreted by pro-inflammatory cytokine treated human RPE cells. Substantial dose- and time-dependent RPE secretion of IL-8 was observed following stimulation with IL-1β or TNF-α, but cell associated IL-8 was detectable only after high dose (20 ng ml⁻¹) IL-1β stimulation and comprised less than 1% of the total IL-8 induced. Dose- and time-dependent RPE cell MCP-1 secretion was also observed following IL-1β>TNF-α>IFN-γ stimulation, with an average of 4% of the total MCP-1 retained within RPE. Bioassays demonstrated neutrophil and monocyte chemotactic activity in conditioned media from stimulated RPE cells, but not in human RPE cell extracts. Inhibition of conditioned media-induced chemotaxis by specific anti-IL-8 or anti-MCP-1 antibodies demonstrated that IL-8 and MCP-1 were responsible for the majority of HRPE-derived neutrophil (>60%) and monocyte (53–57%) chemotactic activity, respectively.Using in situ hybridization IL-8 mRNA was readily detected within IL-1β>TNF-α stimulated RPE cells and MCP-1 mRNA easily visualized within IL-1β>TNF-α> or IFN-γstimulated cells. Immunohistochemistry to detect IL-8 was positive only in RPE cells exposed to high dose IL-1β(20 ng ml⁻¹) for 8 or 24 hr and was weak. Immunohistochemical staining for MCP-1 in RPE cells was more intense and was visualized within RPE cells stimulated with IL-β, TNF-α, or IFN-γ. This study demonstrates that: (1) RPE cells efficiently secrete IL-8 and MCP-1 upon stimulation with pro-inflammatory cytokines; (2) secreted IL-8 and MCP-1 account for the majority of human RPE neutrophil and monocyte chemotactic activity; (3) in situ hybridization readily detects IL-8 and MCP-1 mRNA in cytokine stimulated RPE cells; and (4) immunohistochemistry demonstrates cell-associated MCP-1 in cytokine stimulated RPE cells, but only minimal cell-associated IL-8.     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

Influence of IL-1β and TNF-α on Fas Expression of Human Retinal Pigment Epithelial Cells in Vitro

Purpose: To observe Fas expression change of cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells by IL-lβ and TNF-α. Methods: With flow cytometry, immunohischemistry, and color imaging system, Fas expressions by exposure to IL-1β and/or TNF-α were measured. Results:The gray degree values of Fas expression were 67.5 ±6.1 in IL-1β+TNF-α-treated group, 80.1 ±9.2 in IL-1 β-treated group, and 70.4±6.4 in TNF-α-treated group, respectively. There were significant differences (P ＜ 0.005) compared with control group (107.0±10.2). Flow cytometry showed that 15.0% cultured human RPE cells expressed Fas. Fas-positive in IL-lβ, TNF-α, and IL-lβ+TNF-α-treated groups expressed was 28.1%, 34.5%, and 65.2%, respectively. Conclusion: IL-1 β, TNF-α, and combining both of them can up-regulate Fas protein expression, which may contribute to more Fas (+) cells in proliferative vitreoretinopathy PVR). Minimizing this process by means of inducing apoptosis of Fas (+) proliferative cells of Fas/FasL pathway is a future preventive and therapeutic possibility for PVR. Eye Science 2004;20:39-41.