人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

角膜上皮细胞体外培养技术的研究进展

体外重建组织工程角膜并将其用于角膜移植是使角膜盲患者复明的惟一有效途径,其中角膜上皮种子细胞的来源成为急需解决的关键问题。由于体外生长的角膜上皮细胞生命周期短,因此通过改进体外培养技术来获得增殖能力强的细胞成为解决角膜上皮种子细胞来源问题的首要任务。本研究从角膜上皮细胞的体外培养技术包括培养方法和培养条件这两方面进行了综述。     

人角膜缘干细胞初步建系研究

目的：探讨建立人角膜缘干细胞系，为组织工程研究提供足够的细胞储备。方法：取健康人角膜缘深部色素区组织块，经消化后，在含有RPMI—1640、20％胎牛血清的培养瓶和以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中分别进行体外培养，并对连续传代的细胞行光镜、扫描电镜观察，比较细胞形态的变化并进行细胞计数与冻存处理。结果：人角膜缘干细胞具有人上皮细胞培养的特性，在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长；目前我们冻存细胞的复苏率为82．2％。结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系。     

人角膜内皮细胞增殖特性及能力的研究进展

原发性和继发性角膜内皮失代偿导致角膜基质水肿、角膜混浊和视力下降,其发生的病理生理基础在于成年人角膜内皮细胞失去增殖能力,损伤后无法正常再生。研究发现,人体内角膜内皮细胞增殖抑制主要与细胞接触抑制和房水中的转化生长因子β2有关。细胞周期蛋白和增殖标记蛋白K i67的免疫荧光染色结果显示:人角膜内皮细胞只是停留在细胞周期的G1期,而不是退出了细胞周期。体外培养、扩增人角膜内皮细胞的成功和人角膜内皮细胞永生细胞系的建立充分证明角膜内皮细胞具备增殖能力。体外培养实验显示:角膜内皮细胞增殖能力年轻人强于老年人,角膜周边部强于中央部。体外促进人角膜内皮细胞增殖的因素主要包括细胞生长因子、EDTA和细胞外基质。人角膜内皮细胞的干细胞或前体细胞的分离、鉴定和培养为深入研究角膜内皮细胞增殖机制和内皮细胞体外扩增提供了基础条件。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养和鉴定

目的 建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,通过形态学观察并应用免疫组织化学方法对细胞进行鉴定.结果 兔角膜上皮原代培养第2天,组织边缘有细胞游出,细胞和细胞核均呈圆形,胞核位于细胞中央或旁中央区;第3天,细胞呈扁平多...     

肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞的研究

目的 探索以脱细胞的肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞并研究培养角膜基质细胞特性。方法 将培养扩增的兔角膜基质细胞分别接种到培养板和肾纤维囊上进行体外培养,采用倒置显微镜、免疫组化(波形蛋白)和免疫荧光(AO、PI和Hoechst)的方法进行检测,观察兔角膜基质细胞在培养板和肾纤维囊上的生长情况。结果 倒置显微镜和免疫荧光显微镜观察结果显示角膜基质细胞在肾纤维囊上快速贴壁生长并增殖,细胞形态呈多角形树枝状,多次传代后细胞仍维持原有的形态和功能,细胞能长期培养。在培养板上培养的细胞呈长梭形,细胞贴壁生长和增殖情况稍差。在肾纤维囊上的活细胞较在培养板上培养的细胞多。结论 角膜基质细胞在脱细胞的肾纤维囊载体上生长良好,细胞形态结构明显。本研究为角膜基质细胞的体外培养,提供了简单和高效的方法。     

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的：建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法：应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养,用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征,用苏木精-伊红染色、糖原（PAS）染色,细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果：兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代,原代培养细胞大多48h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层,传代培养细胞次日贴壁10天形成单层。细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性,培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接,结论：应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。     

人表皮生长因子对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察表皮生长因子(EGF)对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用体外培养的牛角膜内皮细胞,在培养液中分别添加不同浓度的人表皮生长因子(hEGF),加药后第3、7天采用MTT法,在酶标仪492nm波长处测定吸光度值观测细胞增殖,并记录细胞形态变化。将体外培养的牛角膜内皮细胞分为二组,常规DMEM培养液组和含50ng/mLEGF的DMEM培养液组,培养3、7天后,应用流式细胞仪检测细胞周期各阶段G1、S、G2期分布。结果与对照组相比,不同浓度EGF组对牛角膜内皮细胞增殖有促进作用且与浓度相关,其中10ng/mL和100ng/mL组作用强于1ng/mL组。EGF加入后3d,对照组S期细胞24.5%,G2-M期细胞0.08%,加药组S期细胞24.6%,G2-M期细胞0.06%。与对照组相比较,各期细胞分布大致相等,无显著差异。加入7d后对照组S期细胞20.8%,G2-M期细胞0.41%,加药组S期细胞18.2%,G2-M期细胞1.55%,细胞分布发生明显变化。结论EGF促进体外培养的牛角膜内皮细胞增殖,并使体外培养的牛角膜内皮细胞的细胞周期发生变化,S期细胞比例下降。     

BIGH3基因突变子R124C的过表达及其对人角膜上皮细胞的影响

目的 对我国常见的BIGH3基因相关性人角膜营养不良的热点突变R124C进行体外定点诱变研究,并构建其真核表达载体,探讨其过表达对人角膜上皮细胞的影响.方法 以pMDl8-T/BIGH3载体为模板扩增野生型BIGH3基因全长编码序列,克隆至真核表达载体plRES2.EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得R124C突变体.瞬时转染体外培养的人角膜上皮细胞,免疫印迹检测野生与突变型BIGH3基因的表达,分别检测细胞培养基中TNF-а的含量,并收集细胞,分析caspase-3活性.结果 PCR成功扩增了野生型和R124C突变型的BIGH3基因,两种重组表达质粒转染人角膜上皮细胞后,免疫印迹检测结果证实其均在细胞中表达.细胞因子TNF-ct分泌量增加,同时R124C型突变也可导致caspase-3酶活性增高.结论应用快速体外定点诱变技术,成功获得突变型R124C-BIGH3基因,转染人角膜上皮细胞后,通过caspase-3途径引起细胞凋亡,并上调分泌因子TNF-а.     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

小鼠小肠上皮细胞的体外原代培养

目的探讨小鼠小肠上皮细胞原代培养的原理和方法。方法取胎龄为17~19d的昆明鼠的小肠,通过3种不同的小肠上皮细胞分离方法进行原代培养。结果体外培养出圆形、多角形单层生长,呈"铺路石样",核周可见许多小空泡并且CK18、碱性磷酸酶染色阳性的细胞。结论应用中性蛋白酶Ⅰ和粗胶原酶Ⅺ消化可获满意的上皮细胞分离效果,细胞贴壁良好。小肠上皮在体外的增殖分化有赖于分离的细胞器中干细胞及短暂分裂细胞的多少以及一些间质细胞的存在。     

骨巨细胞瘤体外原代培养及特性

目的观察骨巨细胞瘤体外培养细胞的形态生长特性及DNA倍体含量。方法取手术切取的骨巨细胞瘤新鲜标本8例,以组织培养法进行原代培养,观察细胞形态、生长曲线,FCM分析其倍体含量。结果骨巨细胞瘤原代培养种可见3种细胞;多核巨细胞可以长期培养。FCM分析显示:5例复发及2例原发病例是二倍体或亚二倍体,1例原发病例是非整倍体。结论单核梭形细胞是骨巨细胞瘤的主要肿瘤性成分;FCM无助于骨巨细胞瘤的预后判断。     

滑膜肉瘤的双相分化特性与诊断

本文报道一例左胸锁关节附近的滑膜肉瘤,肿瘤组织学图象显示恶性上皮样细胞占绝对多数如同癌瘤。通过肿瘤的体外细胞培养及体内异种移植,用光镜、电镜及组织化学方法观察了患者肿瘤、培养细胞及异种移植肿瘤,证实并阐明了滑膜肉瘤的双相分化图象,有助于对滑膜肉瘤复杂图像的了解及正确的诊断。     

生精细胞体外培养鉴定方法的研究进展

哺乳动物和人类的生精细胞体外培养经过近100年的发展,已建立了较好的体外培养系统,人们已能将生精细胞从精原细胞阶段培养到精子细胞阶段,甚至已培养到成熟精子。而生精细胞培养后的鉴定方法还缺乏客观手段,本文主要介绍了生精细胞培养的各种鉴定方法的研究进展现状。     

日本血吸虫肝门型童虫在体外培养中的生长、发育和产卵

本文报导在不同培养基中日本血吸虫肝门型童虫的生理活动、生长、生殖器官的发育和产卵。结果表明:在培养35d 内,不同培养基中童虫雌雄合抱率均有随培养时间延长而升高的趋势;M-841培养基、M-841+影细胞培养基中童虫生长速度快于841培养基,但三种培养基中睾丸、卵巢的生长速度差异无显著性(P>0.05)。培养35 d 时,在以上三种培养基中童虫卵黄腺均可发育成熟。最早于培养10d 时,在 M-841+影细胞培养基中查见体外产出的虫卵。提示 M-841影细胞培养基比较适合于肝门型童虫的体外培养。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及与Bio-gide胶原膜复合培养的实验研究

目的本实验拟研究人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stemcells,hMSCs)分离、培养与鉴定的方法,探讨其作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法体外分离培养hMSCs,进行形态学观察,细胞表面抗原检测;将hMSCs与Bio-gide胶原膜进行体外复合培养,通过倒置相差显微镜,扫描电镜进行观察。结果梯度密度离心法结合贴壁筛选法能获得高纯度高活性的hMSCs。hMSCs可在Bio-gide胶原膜上贴附增殖,并复层生长。结论hMSCs取材方便、创伤小;扩增分化能力强。hMSCs可作为牙周组织工程种子细胞来源。Bio-gide胶原膜可作为细胞生长载体。     

IL-1对离体培养人子宫内膜间质细胞催乳素分泌的影响

目的 观察白细胞介素-1(IL-1)对体外培养的人子宫内膜间质细胞催乳素(PRL)分泌的影响,以探讨IL-1对女性生殖生理的调节作用。方法 采用免疫组化染色方法对腺上皮细胞和间质细胞进行鉴定。结果 腺上皮细胞角蛋白(Keratin)染色呈阳性反应,间质细胞波形蛋白(Vimentin)染色呈阳性。结论 IL-1可以抑制离体培养人子宫内膜间质细胞PRL的产生,并随浓度增加抑制作用增强。     

诱导性建立多能干细胞系

目的建立多能干细胞系,并鉴定其是否具有正常于细胞的特性。方法将原代皮肤标本用胶原酶消化处理,利用成纤维细胞培养基进行培养,然后感染病毒。对挑选的人成体细胞来源的iPS克隆进行扩大培养,并对克隆进行免疫荧光检测和lit-PCR检测,确定表达的分子标志,采用体外三胚层分化来鉴定其生物学特性。结果所获得的iPS细胞经鉴定具有碱性磷酸酶活性。并表达Nanog、SSEA-4、Sox2、TRA-1-60等干细胞特异标记物,可形成拟胚体并在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。结论成功建立了iPS细胞系,为今后的研究提供了良好的细胞模型。     

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.