腺病毒介导BDNF基因转染对大鼠视神经损伤后视网膜中SOD、MDA水平的影响

目的:腺病毒介导脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)转染对大鼠视神经损伤后视网膜中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平的影响。方法:建立大鼠视神经夹挫伤模型,随机分为BDNF腺病毒组、lac-Z腺病毒组和生理盐水组,将药物经玻璃体途径注射入大鼠眼内,并设正常大鼠对照。观察各组不同时间视网膜组织中MDA和SOD的含量变化。结果:正常SD大鼠视网膜组织MDA的含量为(5.21±1.32)nmol/ml,SOD的含量为(1751.57±180.55)U/g·pro。大鼠视神经夹伤后MDA含量升高,SOD含量降低。BDNF腺病毒组视网膜MDA含量为(6.67±1.36)nmol/ml(3d)、(5.72±1.66)nmol/ml(7d)、(5.54±1.03)nmol/ml(14d)and(5.33±1.45)nmol/ml(21d),低于两损伤对照组,而SOD含量为(158.55±173.39)U/g·pro(3d)、(161.24±184.57)U/g·pro(7d)、(1694.49±184.30)U/g·pro(14d)和(1721.75±179.86)U/g·pro(21d),高于两损伤对照组。在3 d、1 wk和2 wk时有显著统计学差异(P<0.05),两对照组间在各时间点均无统计学差异。结论:腺病毒介导BDNF转染对视神经损伤后视网膜损伤具有早期防护作用,其作用可能与BDNF刺激局部的SOD含量增加有关。眼科学报 2002;18:249-252.     

腺病毒介导脑源性神经营养因子基因转染对大鼠视神经损伤后视觉电生理的影响

目的　了解正常及视神经损伤大鼠闪光视觉诱发电位 (F VEP)及眼内应用腺病毒转染脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)基因对F VEP的影响。方法　应用多功能电生理检查仪检测正常大鼠F VEP。建立大鼠视神经不全损伤模型 ,同时将含有BDNF基因的重组腺病毒经玻璃体腔注射到大鼠眼内 ,观察伤后 2h ,1、2、3、4周F VEP中P1波振幅和峰潜时的变化。结果　本实验系统测得的正常大鼠F VEP中P1波振幅为 (15 .5 1± 3.6 7) μV ,峰潜时为 (86 .2 0± 4 .30 )ms(n =2 0 )。视神经不全损伤后急性期P1波振幅降低 ,峰潜时延长 (P <0 .0 1)。BDNF腺病毒组P1波较对照组波幅高 ,峰潜时短 ,且在 1～ 3周具有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论　腺病毒介导BDNF基因转染对大鼠视神经损伤后早期功能的恢复有促进作用。     

腺病毒介导CNTF基因眼内转移对视神经损伤大鼠F-VEP的影响

目的观察腺病毒(adenovirus,Ad)介导的睫状神经营养因子(ciliaryn eurotrophic factor,CNTF)对视神经钳夹伤大鼠闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,F-VEP)的影响。方法采用钳夹视神经法制作大鼠视神经损伤模型,夹伤后分别向各组大鼠伤眼内单次注射Ad-CNTF、PBS、Ad-LacZ、CNTF,分别于伤前和伤后1d、14d、28d检测F-VEP的P1波振幅和峰潜时变化。结果伤后1d,各组P1波振幅大幅下降,峰潜时明显延长。伤后14d,各组P1波峰潜时恢复正常,并维持至28d;Ad-CNTF组P1波振幅(10.79μV±2.38μV)与伤后1d(2.97μV±1.21μV)相比,有部分恢复,且好于各对照组。伤后28d,Ad-CNTF组P1波振幅(14.26μV±2.55μV)比各对照组恢复好,差异非常显著(P<0.01);并且好于本组14d时,差异非常显著(P<0.01)。结论视神经损伤后伤眼内单次注射Ad-CNTF可促进受损视神经传导功能的恢复,并可持续到伤后28d。     

超声微泡介导CNTF基因眼内转染对视神经损伤大鼠作用的研究

背景选择理想的基因载体是当前基因研究和治疗的前提与关键,超声微泡造影剂作为一种新型的基因载体,可安全、快速、有效地增强目的基因的转染和表达。目的观察超声微泡造影剂介导睫状神经营养因子（CNTF）基因转染视神经损伤大鼠对视功能及视网膜神经节细胞（RGCs）存活的影响。方法SD大鼠60只随机分为正常对照组、假伤组、单纯损伤组、单纯质粒组、质粒＋超声组、超声微泡组。采用钳夹大鼠右眼视神经法制作视神经损伤大鼠模型,然后各处理组大鼠分别接受相应的干预处理。质粒采用玻璃体腔注射法注入,超声则采用辐照法进行干预。造模前1d和损伤后第7天检测每组大鼠闪光视觉诱发电位（F—VEP）,并于第7天处死各组大鼠。应用荧光金逆行标记法计数各组大鼠RGCs存活数,采用实时定量聚合酶链反应（real—timePCR）检测大鼠视网膜中CNTFmRNA的表达量。结果损伤后第7天,单纯损伤组大鼠F—VEPP．波的隐含时较单纯质粒组、质粒＋超声组和超声微泡组明显延长,超声微泡组P,波的隐含时短于单纯质粒组和质粒＋超声组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。单纯质粒组、质粒＋超声组和超声微泡组F—VEPP,波的振幅均高于单纯损伤组,超声微泡组高于单纯质粒组和质粒＋超声组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。超声微泡组大鼠与正常对照组比较P,波振幅降低,差异有统计学意义（P〈0．05）。单纯质粒组、质粒＋超声组和超声微泡组平均RGCs数目均明显高于单纯损伤组,超声微泡组平均RGCs数多于单纯质粒组和质粒＋超声组,但少于对照组及假伤组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。超声微泡组CNTFmRNA表达量高于正常对照组、假伤组、单纯损伤组、单纯质粒组和质粒＋超声组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论超声微泡能增强CNTF基因在眼内的转染及表达,对视神经损伤大鼠RGCs早期有明显的保护作用,可有效促进视功能的恢氪．     

荧光金逆行标记检测CNTF基因眼内转移对视神经损伤大鼠的影响

目的通过荧光金逆行标记的方法,检测腺病毒(adenovirus,Ad)介导的睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)对视神经钳夹伤大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)数目的影响。方法采用钳夹视神经法制作大鼠视神经损伤模型,夹伤后向大鼠伤眼内注射Ad-CNTF,在取材前7d进行荧光金逆行标记RGC,于伤后28d,对大鼠的视网膜铺片进行荧光金标记的RGC记数。结果伤后28d,单纯损伤组、PBS组、Ad-LacZ组视网膜标记RGC数均较低;CNTF处理组视网膜标记RGC数为每视野(12.11±2.29)个(n=9),高于前3组,且差异非常显著(P<0.01)。Ad-CNTF组视网膜标记RGC数为每视野(20.93±2.67)个(n=8),在各组标记RGC数中最多,也好于CNTF组,2组间差异非常显著(P<0.01)。结论视神经损伤后眼内单次注射Ad-CNTF,可明显增加钳夹伤后28d大鼠视网膜的标记RGC数。与单次注射CNTF相比,对损伤的RGC具有更加显著的神经保护作用。     

腺病毒介导的脑源性神经营养因子对早期糖尿病大鼠神经视网膜病变的影响

目的:观察玻璃体腔内注射腺病毒介导的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)前后STZ糖尿病大鼠视网膜中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的水平及多巴胺能无长突细胞数目的变化。方法:选取9周龄Wistar大鼠,链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)ip,制成糖尿病模型后2wk,玻璃体腔内注射含有BDNF基因的5型重组腺病毒(Ad.BDNF),模型建立后4wk,处死大鼠,取视网膜组织进行Western blotting及视网膜铺片免疫组织化学染色检测,观察视网膜中TH水平的变化,从而反映糖尿病大鼠视网膜中多巴胺能无长突细胞水平的变化。结果:实验组糖尿病大鼠未注射Ad.BDNF眼视网膜中TH蛋白水平降低,多巴胺能无长突细胞计数及灰度低于对照组,均有统计学差异;实验组注射Ad.BDNF眼视网膜中TH蛋白水平、多巴胺能无长突细胞计数及灰度与对照组无统计学差异。结论:STZ早期糖尿病大鼠玻璃体腔内注射Ad.BDNF可提高视网膜中TH的水平,提高多巴胺能无长突细胞的数目。     

视神经损伤时视网膜睫状神经营养因子受体的表达

目的研究睫状神经营养因子受体于视神经损伤后不同时间在视网膜中的表达情况,探讨外源性的睫状神经营养因子在神经损伤疾病中的应用价值。方法采用钳夹视神经的方法建立神经损伤的模型,在损伤后1、7、14、28d获取视网膜,提取总RNA及总蛋白,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定视网膜中睫状神经营养因子受体(CNTFR)αmRNA的表达,用WesternBlot方法了解损伤后不同时间CNTFRα蛋白水平的表达。结果在正常大鼠视网膜内CNTFRαmRNA无表达,在损伤后的1、7、14、28d均有一定水平的CNTFRαmRNA的表达,与正常对照比较差别具有显著性意义(P<0.01);损伤后备时间均有CNTFRα蛋白的表达,但CNTFRα蛋白的表达较弱。结论神经损伤后CNTF的表达先短暂升高以后持续下调,而CNTFRα-mRNA在损伤后4周内均有一定量的表达,提示补充外源性CNTF可能改善神经再生的微环境而发挥保护效应。     

大鼠视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα mRNA的表达

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子及其受体在大鼠视网膜中的表达变化。方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1、3、7、14、28d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜组织RNA,运用RT-PCR检测视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA的表达变化。结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRαmRNA的表达,视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA表达量逐渐增加,第7d达到最高,第14d下降,具有统计学意义(P<0.01)。28dCNTF表达仍高于正常组(P<0.01)。结论视神经损伤刺激了视网膜细胞表达CNTF和CNTFRα增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应。     

大鼠BDNF基因克隆和重组逆转录病毒pLXSN-BDNF的构建

目的克隆大鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)基因并构建含BDNF基因片段的真核表达载体pLXSN-BDNF,用于视神经损伤修复的基因治疗。方法利用RT-PCR的方法从大鼠海马组织的总RNA中扩增BDNF基因片段,序列两端分别引入限制性内切酶识别位点EcoR I和Xho I,并将其定向克隆入pMD18-T Si mple载体,测序正确后亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN。结果经过PCR、酶切和测序鉴定,所克隆的BDNF基因序列正确,克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中。结论成功克隆了BDNF基因并且构建了真核表达载体pLXSN-BDNF,为进一步研究基因治疗视神经损伤疾病奠定基础。     

脑源性神经营养因子对青光眼视神经保护的研究进展

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BD-NF)是一种具有抑制神经元死亡功能的碱性蛋白质,其研究近年来成为青光眼视神经保护的热点之一。     

Clinical observation of recombinant human nerve growth factor in the treatment of neurotrophic keratitis

AIM: To characterize changes of corneal nerve morphology and tear indices in patients with neurotrophic keratitis (NK) treated with recombinant human nerve growth factor (rhNGF). METHODS: In a prospective observational study, six patients (nine eyes) were locally treated with rhNGF. Visual acuity, corneal fluorescein staining score, the heights of the tear river, lipid layer thickness (LLT), tear ferning (TF) test, conjunctival impression cytology (CIC) examination, the densities of cornea subbasal nerve fibers were determined before and after treatment. RESULTS: Compared with baseline, there was a significant difference in corneal fluorescence staining scores (P<0.01); all patient corneal epithelial defects recovered completely within 8wk, but there was no significant improvement in the height of the tear river (P=0.202). LLT was significantly increased when compared with baseline (P=0.042); however, the function of conjunctival goblet cells and mucin content did not significantly improve using the TF test and CIC examination (P=0.557, P=0.539). After 8wk of treatment, the average corneal subbasal nerve fiber density increased significantly (P<0.01), as did the number of corneal nerve fiber branches (P=0.001). CONCLUSION: RhNGF can increase the density of corneal subbasal nerve fibers, promote the healing of persistent corneal epithelial defects and corneal ulcers in patients with NK, also improving tear function partially.     

腺病毒构建过表达睫状神经营养因子对骨髓间充质干细胞的影响

目的：构建过表达睫状神经营养因子(CNTF)的腺病毒,利用腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞,使其在体外持续高效表达CNTF,为视网膜病变的体外研究提供新途径。

方法：构建空载GFP-腺病毒及CNTF-腺病毒,取第3代BMSCs用于转染实验,分为3组：空白对照组(未转染腺病毒组)、阴性对照组(GFP-腺病毒转染组)和实验组(CNTF-腺病毒转染组)。ELISA测转染后1、2、3d各组上清液的CNTF蛋白分泌量。

结果：成功构建空载GFP-腺病毒及CNTF-腺病毒, 实验组的CNTF表达量明显高于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论：利用腺病毒载体可使BMSCs在体外持续高效表达CNTF。     

重组人色素上皮细胞衍生因子对大鼠视神经损伤的营养保护作用

目的观察本研究所研制的重组人色素上皮细胞衍生因子（rhPEDF）对大鼠视神经夹挫伤后的保护作用。方法健康SD大鼠32只,随机分为4组：对照组及rhPEDF不同浓度（1μg/μL、0.1μg/μL、0.01μg/μL）的3个组。均制成左眼视神经夹挫伤模型,分别于损伤前,损伤后即刻,1周后记录左眼闪光视觉诱发电位（F-VEP）。于损伤当天,第2,4,6天向左眼球后注射各组液体5μL。用药1周后,摘取眼球及视神经,HE染色,光镜下观察形态学改变。结果损伤后,各组F-VEP波峰潜时（P1）均延长,波幅均降低（N1-P1）,与损伤前相比差异有统计学意义（P〈0.05）,造模成功。用药7d后,各组P1值恢复至损伤前,波幅（N1-P1）值有一定恢复。rhPEDF高浓度组与其它3组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）,但仍未恢复至损伤前水平（P〈0.05）。结论本研究所重组的rhPEDF具有神经营养功效。为进一步开发一种新的眼部神经营养因子奠定基础。     

蛇毒神经生长因子对大鼠视神经夹伤保护的电镜观察

目的研究蛇毒神经生长因子在视神经损伤后对视网膜神经节细胞的保护作用。方法将Wistar大鼠40只随机分为实验对照组和实验治疗组。制作实验性视神经夹伤模型,用头部宽1mm的微型血管夹夹伤大鼠右眼视神经后,实验治疗组向伤眼玻璃体腔内注入蛇毒神经生长因子100BU(0.025mL)。实验对照组向伤眼玻璃体腔内注入0.025mL平衡盐液。于损伤后第3d、7d、14d、30d、60d取材,用透射电镜观察不同时间段各组视网膜形态学变化。结果电镜下大鼠视网膜改变:实验治疗组和对照组电镜下均可见坏死和凋亡。伤后14d,实验治疗组视网膜微管数目比实验对照组较多,排列比较整齐。结论在视神经损伤早期,蛇毒神经生长因子能减轻视神经夹伤后微管的损坏,提高视网膜神经节细胞的存活数量,对视网膜神经节细胞有明显的保护作用。