人脐带血造血干细胞的分离和体外扩增

目的 :通过对人新鲜脐带血造血干细胞的体外分离 ,探讨不同细胞生长因子的体外培养体系对CD34+ 细胞的扩增作用。方法 :用SCF、FL、GM CSF、IL 3、IL 6、G CSF、TPO组合成不同的实验组 ,对脐血中分离的CD34+ 细胞进行 2 1d的体外培养 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,从而求得细胞培养较好的细胞因子组合。结果 :不同细胞因子组细胞培养孔CD34+ 细胞比例在培养 7d时已经开始上升 ,10d时继续上升 ,到 14d达高峰 ,继续培养 18d ,CD34+ 细胞比例逐渐下降 ,但仍高于培养前水平 ,培养 2 1d ,CD34+ 持续下降。总细胞数在第一周即扩增 35 .32倍 ,10～ 14d总细胞数扩增 331.7倍 ,2 1d总细胞数扩增 4 2 2 .2倍 ,SCF +IL 3+IL 6 +TPO +FL细胞因子组合对总细胞扩增最多 ,SCF +IL 3+IL 6 +GM CSF +G CSF对总细胞扩增略少 ,其次是SCF +TPO +FL细胞因子组合 ,最少为SCF +IL 3+IL 6 +GM CSF细胞因子组合 ,细胞涂片染色观察 ,体外培养 14d ,细胞胞体小 ,胞浆量少 ,胞核体积大 ,规则 ,为早期造血干细胞。结论 :体外HSC培养 ,细胞因子对细胞的增殖有明显的作用 ,但不同的细胞因子组合对细胞的扩增作用有明显的不同     

多种细胞因子组合对脐血干/祖细胞体外扩增的影响

目的　探讨在体外培养液中不同细胞因子组合对脐血 CD34+ 细胞的扩增作用以及扩增后的 CD34+ 细胞的造血功能。方法　用 FL、SCF、TPO、IL - 3、TL - 6组合成不同的实验组 ,对脐血中分离纯化的 CD34+ 细胞经 6d的短期体外扩增 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,L TC- IC、祖细胞集落群计数 ,从而求得较好的细胞因子组合组。结果CD34+ 细胞扩增倍数为 3 .1～ 8.6倍 ,16份脐血 CD34+ 细胞数达到 10× 10 6 以上的细胞总数 ;扩增的 CD34+ 细胞再造血功能与原始 CD34+ 细胞无显著差异。FL是扩增组合中不可缺少的细胞因子 ,同时还证实 TPO与其他细胞因子组合有扩增 CD34+ 细胞的作用 ,但单独使用 TPO稍长时间会使 CD34+ 细胞过多向巨核细胞分化。结论　 FST3 6细胞因子组合能使部份单位体积的脐血 CD34+细胞体外扩增达一定数量 ,为干细胞移植于成人提供了一定的实验依据与方法     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

脐血造血干/祖细胞体外扩增的实验研究

目的探讨因子组合FL+TPO+SCF+IL-6对脐血CD34 +细胞的体外扩增效应.方法采用Mini-MACS分离纯化出CD34+细胞, 在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况.结果培养4周后,FL+TPO+SCF+IL-6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加(P＜0.05),并且能维持一定比例的CD34+、Th y-1+细胞;SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34+细胞基本检测不到.结论与经典因子组合SCF+IL-3+IL-6+G M-CSF+EPO相比,因子组合FL+TPO +SCF+IL-6能在较长时间内有效扩增脐血造血干/祖细胞, 是一个优化组合方案.     

造血细胞生长因子对脐血CD34+细胞短期体外扩增的作用

目的 探讨造血细胞生长因子(HGF)的不同组合对脐血CD34 细胞短期体外扩增的作用．方法 用免疫磁珠法分高纯化脐血CD34 细胞，培养于无血清培养液中。加入不同的细胞因子，于第4，7，10，14天检测CD34 细胞百分率和有核细胞(NC)总数。结果 和对照组相比，各组的NC扩增倍数随着培养时间的延长虽不同程度的增加，干细胞在FL、TPO，GM-CSF、SCF、IL-6、G-CSF、EPO和IL-3等因子作用下，NC扩增倍数在培养第14天达高峰，为328．96倍；而CD34 细胞扩增倍数在培养第7天达最高峰，但在FL、TPO、GM-CSF、SCF，IL-6、G-CSF等因子作用下，CD34 细胞扩增倍数最大，7d后达25．23倍，而后随着培养时间的延长而逐渐下降。结论 脐血CD34 细胞在HGF作用下，扩增时间以7-10d为最佳。     

条件培养液对脐血CD34^＋细胞扩增效应的实验研究

目的：探讨并分析不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法：利用4种条件培养液（胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞）对脐血CD34^ 细胞进行2周的体外扩增，并和三细胞因子组合：干细胞因子（stem cell factor,SCF)，血小板生成素（thrombopoietin,TPO),flt-3配基（flt-3 ligand,FL)，对脐血CD34^ 细胞扩增结果进行了比较；利用ELISA方法检测4种条件培养液中细胞因子[白细胞介素－1（interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、FL、TPO]的浓度。结果：脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD34^ 细胞均有明显的扩增效应，脐血组优于细胞因子组合；4种条件培养液中，脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论：脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD34^ 细胞有效而廉价的扩增剂；细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞体外扩增结果差异的主要因素。     

CD34+细胞体外定向诱导分化的实验研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对CD34+细胞体外定向诱导分化作用.方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC),在液体培养体系加入不同组合细胞因子对CD34+细胞进行诱导,检测细胞总数、CD71+细胞和CD15+细胞比例及粒单系祖细胞和红系祖细胞扩增数量.结果:液体培养体系中,以FL+Tpo+SCF+IL-3+Epo细胞因子组合对CD34+细胞向红系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD71+细胞比例为61.20%±5.31%,BFU-E、CFU-E分别扩增27.12±3.95和30.65±40.26倍.以FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF细胞因子组合对CD34+细胞向粒系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD15+细胞比例为56.18%±6.57%,CFU-GM扩增29.87±10.52倍.结论:合理组合生长因子,可定向诱导CD34+细胞生成大量血细胞,将有助于满足临床应用的需要.     

不同细胞因子组合对c-kit~+Lin~-细胞的体外扩增研究

目的探讨在无血清无基质条件下，不同细胞因子组合对c-kit^＋Lin^-细胞增殖效应以及最佳扩增时间。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit^＋Lin^-细胞，将干细胞因子（stem cell factor，SCF），FLt-3配基（FLt-3 ligand，FL），血小板生成素（thrombopoietin，TPO），白细胞介素-3（intedeukin，IL-3），肝细胞生长因子（hepatocyte graoth factor，HGF）等细胞因子进行不同组合，体外扩增干细胞14d，于不同时间检测细胞总数和c-kit^＋Lin^-细胞数及比例，并在第10天通过细胞凋亡早期膜变化标记FIFT-Annexin-V，检测细胞凋亡率。结果各组细胞因子均能显著扩增c-kit^＋Lin^-细胞，扩增倍数3～19倍不等。在SCF＋FL＋TPO中加入IL-3或HGF，其效果更明显，c-kit^＋Lin^-细胞在第6天分别扩增4．71和5．15倍，当同时加入时，两者有协同作用。其中SCF＋FL＋TPO＋IL-3＋HGF在第10天扩增程度最为显著，并且凋亡率最低为6．59％。结论在体外短期培养过程中上SCF＋FL＋TPO＋IL-3＋HGF组合能产生大量的c-kit^＋Lin^-细胞，并且最佳培养时期为第10天，为肝干细胞提供种子细胞。     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间.方法脐血CD34+细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液.对其有核细胞数(NC)、表面抗原以及集落形成能力进行监测.结果同对照组相比,扩增组的NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增,扩增高峰分别为第10d和第6d;其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多.第6d,CD34+细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍,第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍.而D组(含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L)扩增的细胞中CD34+及CD34+CD38-含量最高.提示E组细胞分化较D组明显.结论体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题,但扩增中应注意其过度分化,扩增时间以6～10d为宜.     

FL,TPO对人脐带血CD34+细胞体外增殖的影响

[目的]研究Flt-3配体（FL）及血小板生成素（TPO）在无血清培养体系中对人脐带血CD34＋细胞体外增殖的影响．[方法]采用无血清液体培养法，分别用FL，TPO，FL加TPO作用于体外短期培养脐带血CD34＋细胞，利用其计数及集落分析方法评价增殖效果．[结果]分别用FL，TPO，FL加TPO刺激增殖后，人脐带血细胞总数分别增加2．50，5．00，10．10倍，FL加TPO组细胞总数明显高于FL，TPO组；CD34＋细胞分别增殖0．90，1．26，1．61倍；集落总数分别增加2．07，2．27，7．37倍，造血祖细胞CFU-GM产率分别提高3．53，2．40，9．95倍，FL加TPO组产率高于其他组，BFU-E产率分别提高1．45，2．25．6．90倍．[结论]在短期无血清液体培养体系中，FL，TPO对人脐带血CD34＋细胞均具有增殖作用，且两者具有协同作用．     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

体外扩增造血细胞重建小鼠造血功能的实验研究

目的 探讨体外扩增造血祖儿定向诱导功能血红细胞生成的条件及扩增细胞重建长期造血能力的维持。方法 应用免疫磁珠法（ＭＡＣＳ）分离纯化脐带血ＣＤ３４＾＋造血干或祖细胞,在体外液体培养体系中经不同细胞因子的组合进行扩增和定向诱导,并将扩增细胞移植经亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果 ＦＬ、干细胞因子血小板生成素（ＴＰＯ）等细胞因子的不同组合可分别扩增细胞总数、粒系及巨核系造血祖细胞、ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８     

多种细胞因子对人骨髓基质细胞生长的影响

目的:探讨多种细胞因子对骨髓基质细胞生长的影响。方法:分离人骨髓单个核细胞,经培养获得骨髓基质细胞(BMSC),分别用不同的细胞因子组合作用于BMSC,MTT法测细胞增殖。采用Mini MACs系统阳性分离纯化脐血CD34+细胞,用BMSC结合不同的细胞因子组合培养14天后计数CFU-Mix集落数。结果r:hGM-CSF结合FL、SCFI﹑L-6对BMSC生长的增殖作用最明显;BMSC联合SCFI、L-3、FL、G-CSF、EPO对促进CD34+细胞体外集落形成的作用最明显。结论:细胞因子作用下的BMSC扩增有可能应用于造血损伤修复。     

条件培养液对脐血CD_(34)~+细胞扩增效应的实验研究

目的探讨并分析不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法利用 4种条件培养液 (胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞 )对脐血CD+ 34 细胞进行 2周的体外扩增 ,并和三细胞因子组合 :干细胞因子 (stemcellfactor ,SCF)、血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)、flt 3配基 (flt 3ligand ,FL) ,对脐血CD+ 3 4 细胞扩增结果进行了比较 ;利用ELISA方法检测 4种条件培养液中细胞因子 [白细胞介素 1(interleukin 1,IL 1)、白细胞介素 6 (interleukin 6 ,IL 6 )、FL、TPO]的浓度。结果脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD+ 3 4 细胞均有明显的扩增效应 ,脐血组优于细胞因子组合 ;4种条件培养液中 ,脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD+ 34 细胞有效而廉价的扩增剂 ;细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞体外扩增结果差异的主要因素