孕妇血浆中胎儿游离mRNA检测在唐氏综合征产前诊断中的应用

目的探讨孕妇血浆中胎儿游离mRNA含量变化作为唐氏综合征产前筛查指标的可行性。方法选择2007年5月至2008年8月在上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院就诊的26例孕中期(15～26周)妇女作为研究对象,其中13例为单胎行常规产科检查的孕妇(A组),9例为21-三体综合征胎儿的孕妇(B组),4例为其他染色体异常胎儿的孕妇(C组),提取其外周血血浆中游离mRNA,应用QF-PCR技术检测胎盘来源的HPL,β-HCG,TFPI2,DSCR4,LOC90625基因,以此确定母体血浆中的胎儿游离mRNA含量,并同时检测代表母体与胎儿总游离mRNA的18sRNA基因作为内参照。结果除TFPI2基因外,其他4种基因,在21-三体综合征胎儿孕妇组和其他染色体异常胎儿孕妇组血浆中胎儿游离mRNA含量明显高于正常胎儿孕妇组(P<0.01)。结论胎儿游离mRNA可能成为产前筛查唐氏综合征的有效指标。     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA,为无创性产前诊断技术开辟新途径.利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在.用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYS14),确定性别敏感性60%～100%.利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度,妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA,随妊娠周增加胎儿DNA量也增高.另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿,母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段.     

孕妇血浆中胎儿DNA的数量变化的研究

目的探讨孕妇血浆中胎儿游离DNA的数量变化的规律。方法提取68例孕妇血浆中的DNA,用实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术检测其胎儿SRY基因,并对其中怀男胎孕妇外周血浆中的胎儿DNA的数量进行动态分析。结果在怀男胎的孕妇外周血中均检测到了SRY基因,而在怀女胎的孕妇中未检测到。胎儿游离DNA最早出现的时间平均为7.7周,SRY基因拷贝数平均为5.53copies/ml。随孕期的增加,母血浆中胎儿DNA的含量在逐渐增加,并得出各孕周的标准参考值。在分娩后母血中胎儿DNA的含量就显著下降,到分娩后第二天就完全不能检测到。结论孕妇外周血浆中游离DNA的含量变化具有一定的规律,可以利用其进行无创伤性产前诊断。     

游离胎儿DNA高通量基因测序技术在产前筛查的临床应用

目的:探讨应用孕妇血浆中游离胎儿DNA高通量基因测序技术在无创性产前诊断中的可行性.方法:采用化学发光法对22977例孕中期妇女进行唐氏综合征筛查,对筛查结果为高风险的1173例孕妇采用高通量基因测序技术检测母体血浆胎儿游离DNA,分析胎儿染色体拷贝数,检测结果为高危的孕妇再做羊膜腔穿刺及脐血穿刺术进行胎儿染色体核型分析.结果:1173例孕妇中游离胎儿DNA高通量基因测序技术检测出11例染色体高风险胎儿,羊水/脐血核型分析证实其中10例为染色体异常,分别为7例21-三体和2例18-三体,1例13-三体.游离胎儿DNA高通量基因测序技术的敏感度为100.00％(10/10),特异度为99.91％(1162/1163),假阴性率为0(0/1173),假阳性率为0.09％(1/1173).结论:母体血浆游离DNA高通量基因测序技术可用于胎儿染色体拷贝数异常的检测,有准确性高、假阴性和假阳性率低、无创取样的优点,但由于费用较高,可结合血清学唐氏综合征筛查在有条件的地区进行推广应用.     

ERG甲基化作为无创产前诊断唐氏综合征标记的可行性研究

目的探讨ERG基因是否可以作为孕早期血浆中检测胎儿DNA的通用标志物。方法随机选择早期妊娠孕妇70例,并以经体检确定为未孕健康妇女70例、分娩过21-三体胎儿的妇女11例和顺产后3 d妇女20例作为对照组。利用甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ、MspⅠ酶切后进行常规PCR的方法,检测血细胞、绒毛和血浆DNA目的基因ERG21-128序列的甲基化模式,并对妊娠组和对照组样本进行统计学分析。结果位于21号染色体上的ERG基因21-128序列在70例孕8、9、10周孕妇绒毛组织中甲基化而在母体血细胞中未甲基化,绒毛甲基化检出率为100%;在血浆中游离胎儿DNA ERG基因21-128序列的甲基化检出率为77.1%,敏感度为77.1%。其中8、9、10周甲基化差异无统计学意义（P〉0.05）。在70例未孕健康妇女、11例生产过21三体胎儿的健康妇女和20例产后3 d妇女的对照组的血浆中ERG 21-128序列均未甲基化。结论在母体和胎儿DNA中,ERG基因21-128区的甲基化有显著性差异,实验方法也比较简单,提示了ERG是无创性产前诊断DS的一个潜在标记物。     

唐氏综合征高危孕妇血液中游离胎儿DNA与人绒毛膜促性腺激素β亚单位水平变化的关系

目的 探讨唐氏综合征(DS)高危孕妇血液中游离胎儿DNA(fDNA)与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β-hCG)水平变化的关系及意义.方法 选择2005年6月至2008年2月在山东大学附属省立医院和济南市妇幼保健院行孕中期DS筛查的单胎妊娠男胎孕妇,其中DS筛查高危且确诊为妊娠DS胎儿孕妇5例(DS组),DS筛查高危孕妇21例(DS高危组),DS筛查低危孕妇22例(对照组).提取孕妇血浆中游离fDNA,以男性DYS14基因为fDNA的标志物;采用实时定量PCR技术定量检测孕妇血浆游离fDNA含量;采用化学发光免疫分析法测定孕妇血清中β-hCG水平.比较3组孕妇血液中游离fDNA的含量与β-hCG水平,并对两者行Pearson相关性分析.结果 (1)游离fDNA含量:DS组孕妇血浆中游离fDNA含量为(127±58)GE/ml,高于DS高危组的(78±28)GE/ml和对照组的(48±21)GE/ml,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);DS高危组孕妇血浆中游离fDNA含量也高于对照组,差异也有统计学意义(P<0.01).(2)β-hCG水平:DS组孕妇血清β-hCG水平为(97±43)kU/L,高于DS高危组的(58±25)kU/L和对照组的(38±19)kU/L,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);DS高危组孕妇血清β-hCG水平也高于对照组,差异也有统计学意义(P<0.01).(3)游离fDNA含量与β-hCG水平的相关性:3组孕妇血浆游离fDNA含量与血清β-hCG水平均呈正相关关系(r=0.83,P<0.05;r=0.76,P<0.01;r=0.86,P<0.01).结论 孕妇血浆中游离fDNA可作为产前筛查DS的候选指标,但由于游离fDNA与β-hCG水平变化密切相关,因此其价值有待商榷.     

定量检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的应用

目的探讨应用荧光定量PCR技术检测孕妇血浆中胎儿DNA量，了解胎儿DNA和母体DNA随孕周增长的变化，为将来应用于非创性产前诊断做临床前期研究。方法选择妊娠7～42周，B超确诊为单胎的孕妇58例，使用DNA试剂盒提取孕妇血浆中的胎儿DNA，用荧光定量PCR（FQ-PCR）技术测定血浆中β-actin基因和SRY基因的量。结果58例正常孕妇，有37例男性胎儿，检出率为100％。胎儿DNA的量在早孕组为9．08拷贝／ml（3．5～12．8），中孕组为45．41拷贝／ml（14．38～76．5），晚孕组为300．95拷贝／ml（84～840）。21例女性胎儿均未检出SRY基因。结论胎儿DNA随着孕周的增加而增长，母体血浆是进行无创性产前诊断的非常有价值的底物。     

运用O型血孕妇血浆中游离胎儿DNA检测胎儿ABO血型

目的:探讨利用O型血孕妇血浆中游离胎儿DNA检测胎儿ABO血型的可行性。方法:用酚/氯仿法从39例O型血孕妇(孕36~40+3周)且孕男性胎儿的血浆中提取胎儿DNA,巢式PCR扩增血浆中的SRY基因证实胎儿DNA存在,再用特异性序列-聚合酶链反应(SSP-PCR)检测胎儿ABO血型。用常规血清学方法测母体及新生儿血型。结果:10例孕A型血胎儿的孕妇血浆中扩增出A基因8例,6例孕B型血胎儿的孕妇血浆中扩增出B基因6例,23例孕O型血胎儿扩增出O基因而无A或B基因21例,准确性和敏感性分别为89.7%(35/39)和87.5%(14/16)。结论:利用孕妇外周血中游离胎儿DNA检测胎儿ABO血型可行,对诊断和预防新生儿ABO血型不合性溶血病的发生具有积极意义。     

应用实时荧光定量PCR技术检测母体血浆中胎儿游离mRNA的研究

目的:探讨孕妇血浆中胎儿游离mRNA含量变化作为产前筛查指标的可行性。方法:选择39例早中孕期(8～14周)孕妇为研究对象,其中15例行人工流产(A组),11例为稽留流产或胚胎发育异常(B组),13例为正常早孕期单胎孕妇(C组),提取其外周血血浆游离mRNA,应用实时荧光定量PCR技术(QF-PCR)检测胎盘来源的hPL,β-HCG,TFPI2基因,以此确定母体血浆中的胎儿游离mRNA含量,同时检测代表母体与胎儿总游离mRNA的18s rRNA基因作为内参。结果:3组孕妇血浆标本中均检测到hPL,β-HCG,TFPI2基因及18s rRNA基因,且不依赖于胎儿性别,3组样本表达量有差异,B组TFPI2基因显著高于A、C组(P<0.01)。结论:实时荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性较高,作为非创性产前基因诊断的一种方法可应用于临床。胎儿游离mRNA可能成为产前筛查的有效指标。     

荧光定量PCR检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

目的探讨荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）方法检测孕妇血浆中胎儿DNA的可行性，探讨胎儿DNA在孕妇血浆中的含量及其在孕期的变化规律。方法以胎儿SRY基因序列作为胎儿DNA在孕妇血浆中的标志，应用荧光MGB（Minor Groove Binder）探针实时定量PCR方法连续测定30例孕妇在不同孕期和产后共237份血浆标本中胎儿DNA的含量。结果使用该方法最低可检测到20000个女性DNA中的一个男性DNA。孕妇血浆中最早检出SRY序列的时间为孕6^＋6周。孕8周起，所有怀男胎孕妇的标本中均可检出SRY序列，其含量随着妊娠的进展而增高，在晚期妊娠达高峰，产后24～48h血浆中SRY序列检测均为阴性。胎儿DNA在孕妇血浆总DNA含量中的相对浓度分别为孕早期4．88％、孕中期6．10％、孕晚期4．77％。全部实验无假阳性和假阴性出现。结论FQ-PCR方法是一种灵敏度和准确性高，特异性强的定量检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的方法，孕妇血浆中存在高浓度的胎儿DNA，可用于无创伤性产前基因诊断。     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA，为无创性产前诊断技术开辟新途径。利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在。用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYSl4)，确定性别敏感性60％～100％。利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度，妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA，随妊娠周增加胎儿DNA量也增高。另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿，母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段。     

应用套式聚合酶链反应技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿ＤＮＡ的理论,寻找一种非创伤性产前基因诊断的新方法。方法 用套式聚合酶链反应技术对１２例１２￣４０孕周的初产妇血浆中游离胎儿ＤＮＡ进行特异性扩增,扩增的基因为Ｙ染色体短臂单拷贝基因片段（ＤＹＳ１４基因）,扩增片段的大小分别为２３９ｂｐ和１９８ｂｐ,１２例孕妇均采用母体血浆直接作为模板进行套式聚合酶链反应扩增。结果 １０例妊娠男性胎儿孕妇中有８例血浆中出现ＤＹＳ１４基     

胎儿游离DNA浓度低的影响因素及其与妊娠结局的关系

无创产前检测(non-invasive prenatal testing, NIPT)在21三体、18三体和13三体都具有较高的特异性和敏感性,甚至在其他常染色体非整倍体、性染色体非整倍体和微缺失/微重复综合征中也有较高的阳性预测值。NIPT检测的准确性取决于胎儿游离DNA浓度(fetal fraction, FF)。FF与采样孕周呈正相关,与孕妇体重或BMI呈负相关。孕妇年龄、受孕方式、母体血清标志物和胎儿非整倍体均可影响FF。此外,低胎儿游离DNA浓度(low fetal fraction, LFF)还可增加不良妊娠结局风险,如胎儿非整倍体、染色体变异和妊娠并发症等。在临床进行NIPT检测时,应重视FF孕妇。对于两次LFF孕妇,应建议进行后续的遗传咨询和侵入性产前诊断。     

筛查孕妇血清对非21三体染色体异常的遗传咨询价值

筛查孕妇血清以帮助诊断胎儿21三体,在很多地区已成为产前检查的一部分。对筛查结果阳性者采用羊膜腔穿刺术,取材做进一步染色体核型分析。羊膜腔穿刺术除检测21三体外,还可检测在胎儿中较常见的其它几种染色体数目和结构异常。 检测孕13～18周妇女血清β-hCG、雌三醇和甲胎蛋白,用三变量Gaussian分析法计算与母亲年龄相关的21三体发生危险。研究对象均为单活胎孕妇,仅为血清筛查后接受羊膜腔穿刺术者,不含因高龄妊娠或以往妊娠有染色体异常儿,或常规超声波检查发现胎儿畸形的孕妇。核型分析结果仅通过检     

子痫前期孕妇外周血中游离胎儿DNA含量变化

目的探讨正常妊娠不同孕周及子痫前期孕妇外周血中游离胎儿DNA含量的变化。方法对2009年8月至2010年9月西安交通大学第二附属医院外周血样本90例(包括健康未孕10例,正常妊娠40例,子痫前期40例),应用甲基特异性PCR的原理及荧光定量PCR的方法,相对定量法检测u-maspin基因的含量。结果 (1)10例健康未孕样本未检出u-maspin基因;(2)40例正常妊娠样本有34例检出u-maspin基因,各孕期u-maspin基因检出量差异具有统计学意义(P<0.05),u-maspin基因的含量中孕是早孕的4.43倍,晚孕是早孕的5.13倍;(3)40例子痫前期样本均检出u-maspin基因,u-maspin基因的含量子痫前期轻度是正常晚孕的2.39倍,子痫前期重度是正常晚孕的5.78倍。结论孕妇外周血中游离胎儿DNA的含量随着妊娠进展而增加,能够反映子痫前期患病的严重程度。     

孕中期Down氏综合征胎儿的血清AFP

现已确认,孕中期胎儿为Down氏综合征时其母血清甲胎蛋白(MSAFP)含量较正常偏低,羊水中甲胎蛋白(AFAFP)含量亦低于正常中值。机理仍不明,有人认为是由于患儿AFP产量较正常胎儿少,而本文作者的研究结果并非如此。胎儿血清标本来源有二:一是经腹脐带静脉穿刺;另一是流产或死后检查时行心脏穿刺。孕17～28周之间同时测定正常胎儿、Down氏综合征胎儿及其他染色体疾病胎儿血清AFP表明,正常胎儿血清AFP含量在此期内逐步下降。孕20周前三组胎儿血清AFP含量无区别,孕20周后,Down氏综合征胎儿血清AFP含量较正常胎儿下降迅速,而且随妊娠进展其值下降更为显著,这种现象在其他染色体疾     

胎儿游离RNA在产前诊断中的研究进展

传统产前诊断依靠有创性操作,具有潜在风险。目前无创性产前诊断方法集中于从母体血液中分离胎儿细胞或从血清或血浆中提取胎儿游离DNA,二者在临床的应用尚存不足。近年,妊娠妇女血循环中游离胎儿RNA的发现和应用,是无创性产前诊断领域的突破。已经证实,游离胎儿RNA分子主要来源于胎盘,在母体血循环中比较稳定,易于检测。同时,由于其无需依赖于胎儿性别或是父源性多态性位点,临床应用领域优于胎儿游离DNA;结合对分子标记物的定量检测方法更适用于产前诊断领域,并已取得初步成果。预测其具有很好的应用前景。     

胎儿游离RNA在产前诊断中的研究进展

传统产前诊断依靠有创性操作,具有潜在风险。目前无创性产前诊断方法集中于从母体血液中分离胎儿细胞或从血清或血浆中提取胎儿游离DNA,二者在临床的应用尚存不足。近年,妊娠妇女血循环中游离胎儿RNA的发现和应用,是无创性产前诊断领域的突破。已经证实,游离胎儿RNA分子主要来源于胎盘,在母体血循环中比较稳定,易于检测。同时,由于其无需依赖于胎儿性别或是父源性多态性位点,临床应用领域优于胎儿游离DNA;结合对分子标记物的定量检测方法更适用于产前诊断领域,并已取得初步成果。预测其具有很好的应用前景。     

STR-PCR在产前诊断胎儿唐氏综合征中的应用

目的:研究通过多重荧光定量PCR诊断胎儿染色体非整倍体用于临床快速产前诊断的可行性。方法:从孕中期羊水中提取胎儿DNA,通过多重荧光定量PCR使用STR对13、18、21号染色体进行非整倍体筛查,筛查结果异常者再进行快速诊断。用PCR诊断的羊水标本同时使用"金标准"染色体核型分析法做对比。结果:34例羊水标本中2例标本由于母血污染严重未行PCR检测,1例标本经PCR及核型分析均失败,29例标本经PCR和核型分析诊断为正常染色体,2例标本经PCR和核型分析诊断为21-三体。结论:通过STR-PCR法使用多重荧光酶联聚合反应探针产前诊断胎儿唐氏综合征是临床快速产前诊断的有效方法之一。     

母体循环中游离胎儿DNA的起源及诊断潜力研究进展

有关母体循环中游离胎儿DNA的研究一直是热点.胎儿核酸以惊人的稳定性存在于母体循环中,可能由于凋亡体中存在某些保护机制,游离胎儿DNA在母体循环中大量产生和快速变化更为妊娠过程提供了动力学依据.综合各学科理论和现有数据,认为母体循环中游离胎儿核酸主要来源于胎盘,其次也有部分来自胎儿造血细胞系统.由于母体循环中胎儿DNA的相对容易检测,胎儿非整倍体病、子痫前期、胎儿RhD基因型和一些单基因遗传病的诊断与鉴别手段应运而生.有关非性别依赖基因多态性、外遗传标志物以及循环mRNA序列研究的进展最终将使此类技术不受胎儿性别限制而推广应用.