重组人促红细胞生成素纯化工艺

目的:建立适合大规模生产重组人促红细胞生成素(rhEPO)的纯化工艺.方法:采用无血清培养分泌rhEPO工程细胞株,收集培养基上清,经过滤、染料亲和层析,离子交换层析、分子筛层析纯化.结果:所纯化的rhEPO纯度达99%以上,比活(包括体内、体外)为2.0×105IU/mg以上,活性回收率为40%,相对分子量为38000左右,等电点为3.7～4.2.结论:该纯化工艺简便、重复性好、产品质量高,适合大规模生产.     

重组人血管内皮抑素的阳离子交换色谱复性与纯化条件研究

对rhEndostatin包涵体蛋白的色谱复性条件进行研究,摸索出最佳的复性、纯化条件,解决其在大肠杆菌中表达提取时遇到的蛋白变性问题。按实验条件对表达的rhEndostatin包涵体蛋白进行提取、洗涤、变性;利用正交法设计重组蛋白的色谱复性、纯化实验;利用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对rhEndostatin包涵体蛋白进行了色谱复性、纯化。最佳复性条件为rhEndostatin上样浓度为2.5 mg/mL,洗脱体积流量为1/20床体积/min(3.5 mL/min),NaCl浓度0.1 mol/L,GSH/GSSG的浓度比为3/0.3 mmol/L。在此条件下纯度约97%,蛋白回收率为90%,重组蛋白的活性最高,IC50达到5μg/mL。     

快速二步法从复合培养基内大量纯化片球菌素样细菌素及其它带正电荷的抗菌多肽

建立了一种适用于小量和大规模纯化片球菌素样细菌素及其它带正电荷的多肽的快速简单的二步法。第一步 ,将细菌培养物直接上样到阳离子交换柱 (1ml阳离子交换剂 /10 0 ml细胞培养物 ) ,细菌和带负电荷的化合物经柱流出 ,而带正电荷的细菌素随后用 1mol/ L Na Cl洗脱出来。第二步 ,将含细菌素的洗脱液上样到一个低压反相交换柱 ,然后用丙醇洗脱。培养物上清液中的初始活性在两个纯化步骤里都能回收 80 %以上 ,而且通过反相层析和毛细管电泳检测 ,最终得到的细菌素制品的纯度可达 90 %以上快速二步法从复合培养基内大量纯化片球菌素样细菌素…     

胸腺素a_1的分离纯化

化学合成胸腺素a1采用阴离子交换色谱和制备型RP-HPLC两步纯化。阴离子交换色谱以pH8.0的Tris-HCl为缓冲液,0～0.35mol/L NaCl溶液离子强度梯度洗脱;制备型RP-HPLC采用C18柱,流动相A为0.1%三氟乙酸-H2O,流动相B为0.1%三氟乙酸-90%乙腈,线形梯度10%～35%B,0～60min洗脱,流速2.0ml/min,检测波长214nm。纯化结果采用分析型RP-HPLC和Tricine-SDS-PAGE检测,终产物纯度达98.8%以上。     

胸腺素α1的分离纯化

化学合成胸腺素α1采用阴离子交换色谱和制备型RP-HPLC两步纯化.阴离子交换色谱以pH8.0的Tris-HCl为缓冲液,0～0.35mol/L NaCl溶液离子强度梯度洗脱;制备型RP-HPLC采用C18柱,流动相A为0.1%三氟乙酸-H2O,流动相B为0.1%三氟乙酸-90%乙腈,线形梯度10%～35%B,0～60min洗脱,流速2.0ml/min,检测波长214nm.纯化结果采用分析型RP-HPLC和Tricine-SDS-PAGE检测,终产物纯度达98.8%以上.     

重组人干扰素α-2b两步柱色谱分离纯化工艺研究

通过改进柱色谱条件,两步柱色谱分离纯化重组人干扰素α-2b,简化了工艺,缩短了生产流程,纯化倍率达到5.6倍,纯度98%.蛋白比活性1.43×108IU/mg蛋白,活性回收率58%.     

人源化抗人TNFα单克隆抗体纯化工艺的优化

目的考察中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO细胞)表达的人源化抗人TNFα单克隆抗体的亲和色谱过程中的杂质洗脱工艺,优化目的蛋白洗脱工艺条件。方法以目的蛋白回收率和宿主细胞蛋白残留量为评价指标,筛选最佳的杂质洗脱缓冲液;利用实验设计方法,以纯度、洗脱峰pH值、宿主细胞蛋白残留量为评价指标,考察目的蛋白洗脱缓冲液的pH值和浓度对工艺的影响,优化目的蛋白洗脱工艺条件。结果优化后的亲和色谱工艺,在保持目的蛋白高回收率(优化前为86.5%,优化后为86.7%)的同时,可显著降低目的蛋白洗脱峰中宿主细胞蛋白残留量(由1 218×10-6降低至78×10-6),提高目的蛋白纯度(优化前为95.5%,优化后为96.6%),减轻后续纯化压力;提高了目的蛋白洗脱峰的pH值(由3.59提高到4.25),有利于目的蛋白的稳定。结论优化了人源化抗人TNFα单克隆抗体的亲和色谱工艺,本工艺有效、可行。     

AB-8大孔树脂分离纯化柿叶总黄酮的研究

目的 考察AB-8大孔树脂分离纯化柿叶总黄酮的工艺条件及其参数.方法 以总黄酮回收率为指标,采用单因素试验及正交试验,对大孔树脂分离纯化柿叶总黄酮的工艺进行优化,并对比分离前后总黄酮的纯度.结果 优化的工艺条件,上样量为150 mg,上样质量浓度为3.75g/L,上样药液pH为5～6,乙醇洗脱浓度为80％,乙醇洗脱速率为1 BV/h.平均总黄酮回收率达到89.54％,分离后纯度提高到43.38％.结论 用该工艺条件对柿叶总黄酮进行分离纯化,成本较低,分离效果好,可为工业生产提供参考.     

离子交换-反相色谱纯化育亨宾

目的从育亨宾树皮中提取的育亨宾粗品,一般纯度较低(10%左右)。本文研究纯化育亨宾粗品的方法。方法结合离子交换与反相色谱两种方法,考察了洗脱条件对纯化效果的影响。结果采用1×2型阳离子交换树脂,以乙醇-水-氨水(40∶55∶5)为洗脱液,洗脱的育亨宾纯度最高;然后用C18反相色谱进一步纯化,流动相为甲醇-水(含0.01%三氟乙酸),甲醇浓度按3%,30%,40%,95%分阶段增加,洗脱液中的育亨宾纯度提高至71.2%。结论这项工艺具有成本低、收率高、纯度好、步骤少的特点,在天然产物的分离纯化方面具有潜在的应用价值。     

HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺研究

目的:优化HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺条件。方法:考察上柱药液的pH值、药液的浓度、柱径/柱高的比例、洗脱乙醇浓度、洗脱溶剂用量、上样流速考察、最大上样量及洗脱流速,确定纯化工艺条件。结果:HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺条件为上样浓度0.1g生药/mL,流速4BV.h-1,树脂柱径/高比为1∶11,以5倍柱体积水洗脱,继以7倍柱体积50%乙醇洗脱。结论:确定工艺条件下,纯化白芍总苷效果良好,芍药苷的纯度可达50%以上,白芍总苷纯度可达80%以上。     

一种新型尿酸氧化酶四聚体提取纯化方法的建立

目的 建立一种简便、快速的尿酸氧化酶四聚体提取纯化的方法,以适应大规模生产需求。方法 首先通过基因工程的方法获得可以稳定发酵生产尿酸氧化酶的大肠埃希菌菌株,再通过一步萃取法从破碎菌体沉淀中获得尿酸氧化酶蛋白混合物,通过硫酸铵沉淀、离子交换和分子筛层析,最终获得纯化的活性尿酸氧化酶四聚体。结果 通过优化发酵及提取条件,每升发酵液可得到尿酸氧化酶四聚体蛋白约400 mg,其纯度>95%,比活>10 U/mg。结论 建立了一种新的尿酸氧化酶四聚体高效提取纯化的方法。     

角质细胞生长因子-2的发酵及纯化工艺研究

目的研究重组人角质细胞生长因子 2 (rhKGF 2 )工程菌的高密度发酵和提纯工艺。方法通过增加培养基营养成分 ,发酵过程补加葡萄糖 ,获得高产率菌体。细菌裂解液经硫酸铵沉淀、分子筛、肝素亲和色谱和离子交换色谱等方法进行纯化 ,电泳分析结果。结果每 1L发酵液可获得菌体 12 .2g ,表达率达 2 8.7%。纯化后rhKGF 2纯度达 97%。结论rhKGF 2工程菌可获得高密度发酵。纯化工艺适用于rhKGF 2的大量制备     

溶栓素的分离纯化及特性测定

目的研究一种高效分离纯化溶栓素的方法并测定其pI和相对分子质量(Mr)。方法采用阴、阳离子交换色谱等技术分离纯化溶栓素并通过对缓冲体系的pH值、离子强度的调节及对初始供试品pH值的调节来优化纯化过程,以等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF PAGE)和SDS PHGE方法分别测定纯品的pI和Mr。结果溶栓素达到简捷、高效分离纯化的目的,电泳鉴定为一条蛋白质带,并测定溶栓素的pI为4 .5 0、Mr 为35 10 0。结论溶栓素的纯化工艺达到高纯度纯化程度,为进一步研究溶栓素奠定了基础     

离子交换层析在人血白蛋白生产中的应用研究

目的 研究离子交换层析在人血白蛋白生产中的应用.方法 将采用低温乙醇分离工艺分离的组分Ⅳ上清液超滤脱醇后,采用离子交换层析进行纯化.筛选层析用凝胶并优化离子交换层析的样品pH、电导率和上样量.同时采用高效液相色谱检测人血白蛋白中间品和成品的纯度.结果 选用Capto DEAE凝胶作为层析用介质,最适层析条件为:样品pH值6.9、电导率5.0 mS/cm、上样量≤1.2g蛋白/ml凝胶.高效液相色谱检测显示,优化低温乙醇工艺制备的人血白蛋白中间品纯度可达99.44％～100.00％,而且优化低温乙醇工艺制备的人血白蛋白成品纯度(97.77％)高于传统低温乙醇工艺(93.82％).结论 该离子交换层析工艺可在人血白蛋白生产中应用.     

大肠杆菌分泌表达重组人肝再生增强因子的纯化、鉴定与活性研究

目的建立一种大肠杆菌分泌表达型重组人肝再生增强因子(rhALR)的纯化工艺,并对产品进行鉴定和活性研究。方法通过沉淀、色谱等方法的条件优化,建立纯化工艺,通过电泳、HPLC、N-末端氨基酸测序、免疫杂交、同位素掺入、全波长扫描等方法对纯化产品进行鉴定和活性测定。结果建立了rhALR的纯化工艺路线,40%(NH4)2SO4沉淀,Butyl-S FF疏水色谱,CM-S FF离子交换色谱,Superdex-75分子筛色谱纯化,重组蛋白质的纯度大于95%。该蛋白质稳定存在的形式为二聚体,其单体的相对分子质量为15 000。该蛋白质结合辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),对损伤后的肝细胞具有明显的促进作用,明显优于以包涵体形式表达的rhALR。结论从大肠杆菌分泌表达体系能分离纯化得到高纯度、具有生物学功能和活性的rhALR,是潜在的临床治疗肝病药物。     

鹅不食草植物蛋白的纯化与含量测定

目的提取、纯化鹅不食草植物蛋白,并测定其含量。方法采用硫酸铵沉降法提取鹅不食草植物粗蛋白,通过透析、离子交换层析、分子筛层析等方法分离纯化所得粗蛋白。同时利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析蛋白纯化情况,并应用Lowry法测定其含量。结果纯化后的鹅不食草蛋白电泳图谱条带多、清晰,Lowry法测定其蛋白含量高达85%以上。结论鹅不食草植物蛋白的纯化与含量测定方法简便、快捷、准确。为开发利用鹅不食草这一丰富的药用植物资源提供科学依据。     

The determination of nicotinic acid in plasma by mixed-mode liquid chromatography-tandem mass spectrometry following ion exchange solid phase extraction

An assay for nicotinic acid in plasma samples has been developed using ion exchange solid phase extraction in 96-well format followed by mixed-mode ion exchange/reversed-phase liquid chromatography with positive ion tandem mass spectrometry detection. The assay avoids the need for time-consuming derivatisation procedures or involatile ion-pair chromatography reagents. The assay is linear over the wide range 0.05-20 microg/mL, based on a 100 microL sample (correlation coefficient>0.99). The assay is accurate and precise (bias and coefficient of variation<18%) over this calibration range.     

重组人干扰素α2a分离纯化中试工艺研究

目的探索无单克隆抗体亲和层析的重组人干扰素α2a分离纯化工艺。方法用 7mmol·L-1盐酸胍抽提干扰素 ,然后用金属螯合层析、离子交换层析、反相柱层析和凝胶过滤将提取的干扰素纯化。结果目标蛋白纯化了 195 1倍 ,蛋白比活性达 2 4 0× 10 8IU·mg-1,回收率达 30 1%。SDS PAGE检定呈一条带 ,其分子质量约为 19kD ,纯度大于 97%。结论本工艺降低了生产成本 ,易于扩大生产规模 ,适合产业化要求。     

高效液相色谱法在合成多肽分离与纯化中的应用

近年来，多肽药物化学形成并迅速发展成为药物化学的重要分支。而随着分离纯化技术的进展，又大大加快了新活性多肽的发现和合成速度。在多肽合成中．许多杂质显示与产物类似的性质，随着肽链的增长，分离的难度也增大，因此纯化的方法和工艺显得异常重要。本文综述了凝胶过滤色谱、离子交换色谱和反相色谱等高效液相色谱技术在合成多肽分离与纯化中的设计和应用。