双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸方法建立

目的：建立快速且简便的常见腹泻病毒筛检和诊断方法，为及时明确病因、控制病原体的传播以及采取有效的治疗措施，防止抗生素滥用提供病原学依据。方法：对建立的一步法双重RT—PCR进行灵敏度、特异性、重复性分析。并应用该方法对28份疑似病毒性腹泻监测标本进行轮状病毒和诺瓦克病毒核酸检测，同时用普通RT—PCR方法、乳胶凝集法和基因序列分析进行检测结果验证。结果：检测出轮状病毒核酸6份，诺瓦克病毒核酸2份，验证符合率达100％。结论：一步法双重RT—PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸的方法建立，不仅节省了检测过程中的人力、试剂和时间，更重要的是提高了应急筛检的能力，为病毒性腹泻病及时防控和治疗赢得时间。     

马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法人工合成马尔堡病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度。结果建立的马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测方法对马尔堡病毒核酸检测有高度特异性,与1型～4型登革病毒、日本脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为102拷贝/反应。结论该方法灵敏度高、特异性强,适用于对马尔堡病毒的快速检验。     

普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立一种适应国境口岸地区特定鼠种中普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法利用Beacon Designer7.0软件设计引物和探针,以人工合成普马拉病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并验证该方法的灵敏度及特异性。结果模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线y=-3.122x＋38.605,R2=0.995,PCR扩增效率为109.1%,其最低检出限为31.6copies/μl。结论建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,适合于普马拉病毒的快速检测。     

快速荧光定量RT-PCR检测对虾Taura综合征病毒(TSV)的方法建立与应用

目的:建立桃拉综合征病毒快速荧光定量RT-PCR用于提高我市对虾出口检验检疫工作效率和疫病防控。方法:选取TSV基因组的保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,扩增产物长度为73 bp。构建TSV目的扩增片段的质粒为标准品,对TSV的核酸提取、RT-PCR进行优化。结果:TSV核酸提取20 min、RT-PCR34 min,检测灵敏度为0.03 fg/μl,组内的实验变异系数为0.25%～1.17%、组间实验变异系数为1.51%～2.60%,与10种病原微生物无非特异反应,定量标准曲线相关系数=-1。结论:本方法用于TSV核酸定量检测速度极快,灵敏度与特异度高、重复性好、定量准确,各项指标均优于标准方法。     

新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针。以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的最佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析。结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CCHFV-FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,57℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2 copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应。结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测。     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

半巢式RT-PCR法检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、敏感、特异的人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)检测方法。方法根据RSVF基因的保守序列设计3条引物，建立半巢式RT-PCR(semi-nested RT-PCR)检测方法。用该方法检测125例患急性下呼吸道感染的婴幼儿的鼻咽吸引物(nasopharyngeal aspirates，NPA)标本，同时对标本进行病毒分离和直接免疫荧光法检测。结果该半巢式RT-PCR灵敏度为0．1TCID50，用该方法在125例标本中共检出RSV阳性标本63例，阳性率50．4％。结论建立快速、敏感、特异的RSV半巢式RT-PCR检测方法，该方法适用于临床早期诊断和流行病学监测。     

食品中诺如病毒RT-PCR检测技术研究进展

诺如病毒(Norovirus,NoV)是急性胃肠炎暴发的重要病原,其特殊的生物学特性容易引起食品的污染。对食品中NoV的准确检测能为诺如病毒胃肠炎防控提供科学依据。反转录(RT)-PCR技术是目前食品NoV检测的主要方法,检测过程包括病毒富集、RNA提取、引物设计、RT-PCR反应、扩增产物鉴定共5个步骤,其中病毒富集是检测的关键及难点。影响食品中NoV的RT-PCR检测结果的因素较多,目前尚无一种标准的检验方法,因此有必要加快相关检验方法研究,建立高风险食品的病毒检测方法以指导实际工作。     

048食品中诺如病毒RT-PCR检测技术研究进展

诺如病毒（Norovirus，NoV）是急性胃肠炎暴发的重要病原，其特殊的生物学特性容易引起食品的污染。对食品中NoV的准确检测能为诺如病毒胃肠炎防控提供科学依据。反转录（RT）-PCR技术是目前食品NoV检测的主要方法，检测过程包括病毒富集、RNA提取、引物设计、RT-PCR反应、扩增产物鉴定共5个步骤，其中病毒富集是检测的关键及难点。影响食品中NoV的RT-PCR检测结果的因素较多，目前尚无一种标准的检验方法，因此有必要加快相关检验方法研究，建立高风险食品的病毒检测方法以指导实际工作。     

双重实时逆转录聚合酶链反应检测甲型和乙型流感病毒

目的:建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)以检测甲、乙型流感病毒。方法:设计甲、乙型流感病毒M基因的特异性引物及双标记探针,优化反应条件,建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)。设计甲型流感病毒HA1、HA3亚型的H1、H3、N1、N2基因的特异性引物,建立双重普通RT-PCR(DRT-PCR)方法。对HA1、HA3和B型细胞分离株进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测。对80份发热病人咽拭子标本进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测及细胞培养分离病毒。结果:DqRT-PCR检测甲型和乙型靶DNA片段(重组质粒)最低极限为1×103拷贝。DqRT-PCR和DRT-PCR对11株H1N1、16株H3N2和12株乙型细胞分离株检测,符合率100%。DqRT-PCR、DRT-PCR和细胞培养分离病毒对80份咽拭子标本的阳性率分别为:37.5%(30/80)、30.0%(24/80)和43.8%(35/80),检出率差异未见统计学意义(2χ=5.5,P>0.05)。与细胞培养分离病毒法比较,DqRT-PCR的阳性和阴性总符合率为73.7%(59/80),阳性预测值为62.9%(22/35),阴性预测值为88.9%(40/45);经配对2χ检验,差异无统计学意义(2χ=0.76,P>0.05)。结论:建立DqRT-PCR可应用于甲型和乙型流感的检测,以多种检测方法互补将有助于提高临床标本的病毒检出率。     

军团菌双重PCR检测方法的建立及应用

目的建立双重PCR以检出环境水体中的军团菌。方法设计2对引物,分别扩增军团菌的5SrRNA和Mip基因,扩增片段长各为10 4bp和996bp。结果该方法检测军团菌的灵敏度为5 8×102 cfu/ml, 6株标准嗜肺军团菌均扩增出104bp和996bp两条带, 4株非嗜肺军团菌均扩增出104bp条带, 4株非军团菌无条带;检测71份环境水样, 5份出现2条条带, 2份可见104bp条带,阳性率为7 0%。结论该方法快速、灵敏、特异,为水体中的嗜肺军团菌检测提供了有效方法。     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。     

用RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测诺沃克病毒的比较分析

目的:研究用不同方法检测诺沃克病毒核酸的阳性率关系,为进一步完善诺沃克病毒核酸的实验室检测提供依据。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-tim e RT-PCR)两种方法,对124例腹泻标本进行诺沃克病毒核酸的检测。结果:124份标本中,RT-PCR检出诺沃克病毒阳性31例,阳性率为25%;实时RT-PCR检出阳性37例,阳性率为29.84%;两种方法均阳性的28例,均阴性的84例,符合率为90%;不同性别阳性率无显著性差异;采用实时RT-PCR检测诺沃克病毒,敏感性较RT-PCR高,但两种方法的阳性率无统计学差异。对于强阳性样本(Ct值在20以内或电泳结果特异性条带很亮),两种方法检出率均为100%;对于弱阳性样本,则大部份标本实时RT-PCR检出阳性而RT-PCR未能检出,少部份标本RT-PCR检出阳性而荧光RT-PCR未能检出。结论:对于诺沃克病毒的实验室检测方法,首选实时RT-PCR;在可能的情况下,应该RT-PCR和实时RT-PCR两种方法联用进行检测,以避免发生弱阳性样本漏诊的情况。     

贝类及其产品中甲型肝炎病毒RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速、简便、灵敏的检测贝类中甲型肝炎病毒RT-PCR方法,能够有效防止甲肝病毒的传播和对口岸进口贝类产品的监控。方法通过对病毒富集的3种方法(大体系PEG8000、小体系PEG6000和小体系PEG8000富集法)、提取RNA的2种方法(Trizol法和试剂盒法)以及RT-PCR检测的2种方法(一步法和两步法)进行比较,确立一种快速检测贝类中甲肝病毒的RT-PCR方法。结果经比较,采用小体系肠道样本检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了小体系PEG8000与PEG6000和大体系PEG8000对病毒富集的效果,回收率分别为13.3%、7.5%、10.0%;对HAV总RNA的2种提取方法进行了比较,结果均获得了纯度较高、完整性较好的总RNA,以此为模板采用一步法和两步法进行反转录和PCR反应,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,从人工污染的阳性样本中扩增得到一段长度为192bp的特异PCR扩增产物。应用本研究建立的RT-PCR方法对大连地区85份贝类及产品进行HAV检测,结果未显阳性,说明样本中不含HAV。整体用时仅为5h。结论本研究建立的检测HAV的RT-PCR方法灵敏特异、操作时间短,该方法可对贝类及其产品进行确实有效的HAV的检测。     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。     

RT-PCR快速检测腮腺炎病毒

目的：建立腮腺炎病毒的核酸快速诊断技术。方法：在腮腺炎病毒核蛋白基因（NP）的保守区域设计一对半引物，采用逆转录聚合酶链（RT-PCR）和半巢式PCR方法扩增腮腺炎病毒特异性核酸片段。结果：该方法能特异性地扩增腮腺炎病毒357bp和232bp的核酸片段，而对麻疹、风疹和流感病毒无交叉反应。检测腮腺炎病毒的灵敏度，1次PCR可检测出10CCID50，2次PCR反应可达0.1CCID50。采用该方法从流行性腮腺炎患含漱液标本中能直接检出腮腺炎病毒核酸条带。结论：该方法能特异、敏感地检测临床标本中腮腺炎病毒，是快速诊断腮腺炎病毒感染的理想方法。