嗜肺军团菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用

目的建立一种灵敏、快速、安全、方便适合口岸现场应用的嗜肺军团菌检测方法。方法分析嗜肺军团菌基因组序列,选择特异性基因片段设计引物,建立环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LMAP)方法,并优化反应条件。结果建立的方法特异性好,灵敏度可达103cfu/ml,检测能力与荧光定量PCR法相当。结论应用环介导恒温扩增技术建立的嗜肺军团菌检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。     

嗜肺军团菌核酸等温扩增快速检测技术研究

目的建立一种嗜肺军团菌的核酸等温扩增试纸条及pH显色快速检测方法,从而实现对空调冷却水样中嗜肺军团菌的快速现场检测。方法基于嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,建立环介导等温扩增体系,并结合反应产物横向流动试纸条和pH显色检测技术,进而验证方法的灵敏性、特异性,并对浙江省不同地区的中央空调冷却水水样进行检测。结果环介导的等温扩增试纸条及pH显色检测方法灵敏度可高达3 cfu/μl,特异性好,且检测时间仅需40 min左右。检测的灵敏度与荧光定量PCR的方法基本一致,对外环境空调冷却水的检测阳性率与荧光定量也相符。结论建立的嗜肺军团菌试纸条与pH显色快速检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。     

嗜肺军团菌的环介导等温扩增检测技术研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的嗜肺军团菌的检测方法。方法利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,根据嗜肺军团菌mip基因的特征性保守序列,设计LAMP检测引物,建立LAMP检测方法,用常规PCR检测平台和其他21种致病菌评估该方法的特异性、灵敏度、重复性及实用性,同时以荧光法建立反应阈值与模板初始浓度之间的线性标准曲线。结果建立的LAMP方法检出限为1.0×102copies/μl,与其他致病菌无交叉反应,反应阈值与初始模板浓度有良好的线性关系(R2=0.9843),LAMP检测结果与传统分离培养方法具有良好的吻合性。结论环介导等温扩增技术检测嗜肺军团菌简便、快速、敏感度高,具有广阔的应用前景。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测嗜肺军团菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物(2条内引物、2条外引物及1条环引物),并对LAMP反应条件和反应体系进行优化.为验证该方法的特异性、敏感性,针对种系背景明确的12株嗜肺军团菌实验对照菌株、45株嗜肺军团菌地方分离株、6株非嗜肺军团菌、11株其他细菌以及59份外环境水样本进行检测,并将其结果与传统培养分离方法及定量PCR方法比较.结果 所检测的菌株样本中不同血清型嗜肺军团菌经LAMP检测均呈绿色为阳性,非嗜肺军团菌及其他菌株检测均呈橙色为阴性.实验结果表明,LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR.应用该方法从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右,该体系检测灵敏度为5 cfu/ml,而且其检测结果在日(灯)光下通过肉眼即可判断.结论 实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测嗜肺军团菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用.     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立

目的：建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法：利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果：该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies／μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论：该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。     

快速检测空调冷却水中Lp1型嗜肺军团菌实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立嗜肺军团菌Lp1型实时荧光定量PCR检测方法,以实现对中央空调冷却水中嗜肺军团菌Lp1型的快速检测。方法基于Lp1型嗜肺军团菌基因组ORF11区域设计特异性的引物和探针,建立体系,验证方法的灵敏度、特异性和重复性,并对模拟的中央空调冷却水水样进行检测。结果该方法的检测灵敏度达3.8×10 cfu/ml,具有良好的特异性,仅嗜肺军团菌Lp1型菌株呈阳性结果,重复检测平均Ct值变异系数。对模拟的水样进行检测,与方法的灵敏度相一致,且具有良好的重复性。结论该方法可实现对嗜肺军团菌Lp1型的快速检测。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因.方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给.利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等.结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现.检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会.结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测.     

套式聚合酶链反应法检测军团菌

应用套式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）技术，建立了扩增嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强因子（ｍｉｐ）基因序列的方法。对１４株标准军团菌和５株标准大肠埃希氏菌等进行检测。结果仅嗜肺军团菌扩增出６４９ｂｐ特异性片段，扩增灵敏度为１００ＣＦＵ／ｍｌ。对１７份人血标本进行检测，表明军团菌ｎｅｓｔ－ｅｄ－ＰＣＲ的敏感性明显高于血清学检测和细菌培养     

嗜肺军团菌荧光定量PCR法的建立和初步应用

目的建立嗜肺军团菌特异、快速检测方法,探讨南京地区公共场所环境水样嗜肺军团菌污染状况。方法根据嗜肺军团菌的mip基因保守序列设计引物和探针,通过对嗜肺军团菌标准株ATCC33152、嗜肺军团菌南京分离株及大肠埃希菌ATCC25922、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、福氏2a志贺菌ATCC12022进行检测,验证该方法的特异性。并应用该法对南京地区某商场、宾馆、办公楼、医院共计13家的中央空调系统的冷却水、淋浴水和景观水共计88份环境水样进行了PCR检测及军团菌的分离培养。结果该法对嗜肺军团菌有特异性扩增曲线,而对其他细菌无阳性扩增曲线。88份水样中荧光定量PCR方法检测出28份阳性,阳性率为31.8%;传统培养方法分离出17株军团菌,分离率为19.3%。结论本文建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,可用于环境水中军团菌污染状况调查。南京地区中央空调冷却水中检出率最高,存在发生军团菌病的可能,应引起足够重视。     

小儿军团菌病的快速检验及临床特征

目的:探索快速准确的诊断军团菌感染的方法,了解儿童军团菌感染的临床特点。方法:根据嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子(m ip)基因建立一种检测嗜肺军团菌(LP)PCR方法,用该方法对65例呼吸系统炎症患儿的痰及咽拭子进行PCR检测,用传统血清学TAT方法检测嗜肺军团菌各型抗体。结果:嗜肺军团菌1~14型均扩增出628 bp的特异性片段,而非嗜肺军团菌LM及肺炎球菌均未见扩增片段;敏感性为2.1 pg/μl的嗜肺军团菌DNA。65例临床标本中6例扩增出628 bp的基因片段,阳性率为9.23%,其中4例应用TAT方法检测Lp抗体也为阳性。此6例患儿临床均为肺炎。结论:①利用嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子(m ip)基因建立的检测嗜肺军团菌PCR方法特异性高,敏感性强,适用标本范围广,在嗜肺军团菌早期诊断中有一定价值。②在儿科呼吸系统感染性疾病中,存在嗜肺军团菌感染,在本资料中,65例呼吸道感染患儿,PCR方法检出6例,嗜肺军团菌感染阳性率为9.23%,而TAT方法检出4例,阳性率为6.15%。说明PCR方法敏感性高于TAT方法。③嗜肺军团菌感染在临床常表现为以重症肺炎、难治性肺炎为主的全身性感染,临床表现不典型,易误诊、漏诊,应引起儿科医师的警惕与重视。     

军团菌快速检测方法的建立及其在国境口岸的应用

目的:建立适合口岸出入境大厅及其他公共设施中央空调水的分子生物学检测方法,以实现中央空调水的快速检测,提高检测速度及灵敏度。方法:根据军团菌核酸序列多重比对结果设计并合成实时荧光PCR的引物和探针,分别对军团菌16SrDNA和Mip基因相应片段进行扩增;建立快速、特异的军团菌分子快速检测新方法,并将该方法应用于对口岸中央空调水进行快速检测。结果:本研究以16SrDNA目标序列检测结果判断样本中是否存在军团菌,以Mip目标序列检测样本中是否存在嗜肺军团菌;本研究的方法快速、特异,能在2 h内完成对空调水样的检测。结论:本方法大大提高了军团菌的检测速度,提高了检测灵敏度,非常适合应用于中央空调水的快速检测。     

多重PCR快速检测空调冷却塔水中军团菌

目的 传统的方法分离培养军团菌，时间长，价格贵，培养较困难，本文建立多重PCR方法，快速检测空调冷却塔水中军团菌属和嗜肺军团菌种。方法 利用军团菌属保守基因片段16SrRNA和嗜肺军团型菌巨噬细胞感染增强因子（mip）基因序列的特异性引物，对空调冷却塔水样中分离的疑似军团菌株进行特异性扩增，并且为了增强敏感性，运用递减温度PCR扩增。结果：PCR扩增的阳性结果与生化培养和血清学鉴定为军团菌的菌株结果—致。结论：与传统的分离培养方法相比，多重PCR方法检测军团菌，快速敏感，成本低，具有较好的特异性。     

嗜肺军团菌不同分子分型方法检测

目的 采用2种分子分型方法对冷却塔水中嗜肺军团菌进行检测分析.方法 分别应用扩增军团菌巨噬细胞感染力增强因子基因(Maerophage Infectivity Potentiator,MIP)后测序的分型方法以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)对48株嗜肺军团菌进行分型.结果 MIP分型方法将48株嗜肺军团菌分为5类,分别为L pnuemophile-phil-1、L.pnuemophile-phil-sg3、L. pnuemophile-phil-D-15、L.pnuemophile-phil-sg10、L pnuemophile-phil-97-2898,其中L.pnuemo-phile-phil-1为优势菌群,占60.4%.PFGE分型方法将48株嗜肺军团菌分为23类,无优势菌群.结论 PFGE分型方法具有更高的分型能力,更有利于流行病学溯源、调查.     

军团菌rcp毒力基因的聚合酶链反应检测方法研究

目的 建立军团菌rcp毒力基因聚合酶链反应(PCR)检测方法.方法 根据GenBanK公布的嗜肺军团菌核苷酸序列合成军团菌rcp毒力基因的特异引物,采用PCR方法对2005年-2007年天津市中央空调冷却塔分离的16株嗜肺军团菌、杜氏军团菌(Legionella dumoffii,L.dum)、博氏军团菌(Legionella bozemanii,L.boz)、长滩军团菌(Legionellafeeleii,L.fee)等菌株进行了军团菌毒力基因rcp的检测.结果 3株嗜肺军团菌扩增出了900 bp的rcp基因片段,其余菌株未扩增出该基因片段.结论 本研究建立的军团菌毒力基因rcp的PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,适于军团菌毒力基因的深入研究.

Abstract：

Objective To establish a polymerase chain reaction method for the detection of the rcp virulence gene of L. pneumophila. Methods Sixteen strains of Legionella pneumophila, L. dumiffii, L. bozemanii and L. Longbeachae isolated from the cooling towers of the centralized air-conditioning systems in Tianjin form 2005 to 2007 were detected by polymerase chain reaction method using L. pneumophila rcp virulence gene-specific primer according to GenBank published nucleotide sequence. Results The 900 bp rcp genetic fragment was amplified in three strains of L. pneumophila, while others not. Conclusion The rcp virulence gene-based polymerase chain reaction method for the detection of L. pneumophila has been successfully established and is the foundation for the studies of Legionella virulence.     

基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型基因检测

目的 建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病58型基因检测体系，用于其快速检测和早期诊断。 方法 运用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V5, 针对人乳头瘤病毒58型的L1区域保守基因设计引物，在反应前加入荧光核酸染料SYBR Green Ⅰ，并对该反应体系中的dNTPs、Mg2+和内引物（FIP、BIP）浓度进行优化,优化结果通过“S”型扩增曲线判断，并对优化后的实时荧光环介导等温扩增体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。 结果 针对人乳头瘤病毒58型所建立的实时荧光环介导等温扩增检测体系具有良好的特异性及灵敏度，且与临床实验室检测结果（qPCR方法）的符合率达100%，该检测方法的灵敏度可达10拷贝/μL。 结论 本研究建立了人乳头瘤病毒58型的实时荧光环介导等温扩增检测体系，它是一种耗时少、操作简便、特异性强、灵敏度高的方法，适用于HPV临床样本的快速检测。     

传统细菌培养法与荧光PCR法分离公共场所嗜肺军团菌结果比较

目的：对公共场所环境样本（水、土壤、气溶胶）进行嗜肺军团菌监测,掌握南京市公共场所中军团菌的污染情况和菌型分布。方法：对12家商场、医院中央空调系统采集水样（冷却水、景观水、淋浴水、自来水）,土壤类样品（背景土、花卉土、风管积尘、景观土）,采用传统细菌培养法及荧光PCR法进行嗜肺军团菌的分离鉴定。结果：12家单位共采样234份（水样88份、土壤146份）,传统细菌培养法检出嗜肺军团菌9份（主要类型为Lp1型）,检出率为3.85%;而实时荧光PCR法检出47份阳性（主要类型为Lp1型）,检出率为20.08%。两者检出阳性率比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：南京市公共场所存在嗜肺军团菌污染,荧光PCR法总检出率明显高于传统细菌培养法,荧光PCR方法较培养法灵敏性较好。     

Legiolert酶底物法与传统培养法对公共场所水体样本中嗜肺军团菌检出结果的比较

目的比较Legiolert酶底物法与传统培养法对公共场所水体样本中嗜肺军团菌的检出效果。方法分别利用Legiolert酶底物法与传统培养法对采集于公共场所的冷却水、淋浴水样本进行嗜肺军团菌检测,并对分离株进行验证及血清分型。结果共采集并检测样品68份,传统培养法与Legiolert酶底物法的检出率分别为5.88%(4/68)及35.29%(24/68),差异有统计学意义(χ2=16.41,P<0.01)。两种方法的检测符合率为64.71%(44/68),检测效果的差异有统计学意义(配对χ2=16.41,P=0.000)。分离出的25株嗜肺军团菌血清型以LP1为主(14/25)。结论Legiolert酶底物法对公共场所水体样本中嗜肺军团菌的检出率高于传统培养法。     

嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应用研究

根据嗜肺军团菌基因组ＤＮＡ的种特异性ＤＮＡ片段序列，合成一对引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。经琼脂糖凝胶电泳、ＥＢ染色结果表明，一条８７０ｂｐ的核苷酸区带为嗜肺军团菌１～１４血清型菌株所共有。ＰＣＲ检测水中军团菌，其敏感性为３５０ｃｆｕ／ｍｌ，而用同位素标记探针、斑点杂交法检测，其敏感性为４３ｃｆｕ／ｍｌ。ＰＣＲ检测人工感染嗜肺军团菌的豚鼠组织标本，阳性率为８３．３％，而细菌分离培养的阳性率仅为２６．６％。在现场调查中，用ＰＣＲ法初步验证了一起由Ｌｐ１０引起的军团菌病爆发。上述结果表明，ＰＣＲ法能快速、敏感、特异性检测嗜肺军团菌感染。