焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1流感病毒基因突变中的应用

目的基于焦磷酸测序技术建立一种快速、简单、高通量检测甲型H1N1流感病毒HA基因受体结合多突变位点的方法,以分析其基因变异的情况。方法用狗肾传代细胞(MDCK细胞)分离病毒,用RT-PCR扩增H1N1病毒血凝素基因中的HA1片段,在生物信息学分析的基础上,针对血凝素基因含有受体结合位点的序列,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含H1N1病毒受体结合位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的受体结合位点基因特征。结果建立了基于焦磷酸测序技术的甲型H1N1流感病毒多突变检测方法,实现甲型H1N1流感病毒HA1基因受体结合位点的高通量检测。青岛地区甲型H1N1流感病毒受体结合位点204、239氨基酸序列还没有发生变异。结论本方法可准确、高通量、快速检测甲型H1N1流感病毒HA1基因受体结合位点突变,为甲型H1N1流感病毒的监测提供一种有效的方法。     

甲型H1N1流感病毒抗原HA基因进化分析

目的 分析甲型H1N1流感病毒抗原HA基因的突变和分子进化树.方法 由河南省各市(地)疾病预防控制中心和流感监测哨点医院采集流感患者咽拭样本,从咽拭样本中分离甲型H1N1流感病毒毒株,选择20株提取病毒RNA,设计引物运用逆转录-聚合酶键反应(RT-PCR)技术扩增编码HA蛋白的基因序列,测序分析核酸和编码的蛋白序列突变位.结果 分离到51株新型H1N1流感病毒;扩增20株HA编码基因,18株成功扩增到HA编码基因,2部分基因片段分别为1 024 bp和654 bp,与预期大小相符;BLAST分析结果显示,在中国多个地区分布有甲型H1N1流感病毒HA基因433 T/C(N端145 S/P)突变株,进化树分析结果显示,这一位点的突变有可能是来自于猪-人之间相互感染.结论 甲型H1N1流感病毒抗原HA基因在中国内地传播期间个别氨基酸位点发生了突变,但是抗原性未改变.     

亳州市2013年甲型H1N1流感病毒基因分析

目的分析亳州市2013年一所学校流感暴发疫情甲型H1N1流感病毒基因及抗原变异情况。方法从132名具有流感症状的学生当中随机采集10份标本,用Realtime RT-PCR方法鉴定甲型H1N1流感病毒,对阳性标本接种MDCK细胞,分离流感病毒,并对甲型H1N1流感病毒株进行血凝素（HA）作基因测序,分析基因及氨基酸位点变异情况。结果 10份标本中Realtime RT-PCR鉴定有8份为甲型H1N1流感病毒核酸阳性,病毒分离培养6份阳性,并对其进行基因测序,HA基因与疫苗株同源性为98.4%,HA基因氨基酸变异分析显示,有多个位点发生变异。结论此次暴发的甲型H1N1流感病毒的基因组HA序列与我国及其他国家的甲型H1N1流感病毒具有较高的同源性,HA基因氨基酸序列发生变异情况,需密切关注甲型H1N1的流行状况。     

2014-2016年镇江地区甲型H1N1流感病毒分子进化特征研究

目的 了解镇江地区甲型H1N1流感病毒流行和变异特点。方法 收集2014-2016年镇江地区哨点医院流感样病例标本,进行核酸检测和病毒分离。在病毒流行期按月随机抽取13株甲型H1N1毒株,设计特异性的引物扩增血凝素（hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因,进行测序并分析其遗传进化特征。结果 13株分离株与疫苗株A/California/07/2009的HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.3%~100.0%和96.6%~100.0%;NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为95.6%~97.5%和93.8%~96.6%。系统进化分析表明,13株病毒HA和NA基因分属于不同的进化谱系。分子特征表现为12株HA氨基酸序列均发生了抗原位点Sa区K173Q突变,1株同时发生了Sa区K181E突变;3株还发生了Ca1区V183I突变。受体结合位点和糖基化位点的氨基酸序列均未发生变异。结论 2014-2016年镇江地区甲型H1N1流感病毒与疫苗株相比,其HA、NA基因出现了一定程度的变异,但是抗原性并未发生改变,需进一步加强监测。     

新型H1N1流感病毒HA基因特性分析

目的:了解新甲型H1N1流感病毒HA基因特性。方法:设计3对引物,对9株天津地区新甲型H1N1流感病毒阳性的咽拭子标本核酸进行RT-PCR扩增,后对产物测序,将测序结果通过软件进行拼接,得到HA基因全长,分析序列特征并绘制种系发生树。结果:9株新甲型H1N1流感病毒HA基因片段测序成功,经序列拼接后,长度为1778 bp,截取开放读码框内1702 bp核苷酸,绘制了种系发生树。新甲型H1N1流感病毒HA基因与经典的猪流感病毒亲缘关系最近,聚在一个分支上。天津地区新甲型H1N1流感病毒HA蛋白氨基酸与WHO推荐的疫苗株A/California/07/2009(H1N1)及中国的代表株A/Sichuan/1/2009(H1N1)相比,同源性很高,为98.8%～99.6%。氨基酸序列与WHO推荐的疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比,有4个位点发生变异,与中国的代表株A/Sichuan/1/2009(H1N1)相比,有3个位点不同。结论:新甲型H1N1流感病毒HA基因源于经典猪流感病毒,目前的新甲型H1N1流感病毒的HA蛋白变异还很小,但应密切关注该病毒的变异情况。     

上海市闵行区甲型H1N1流感病毒株变异分析

目的:了解上海市闵行区人群中甲型H1N1流感病毒株基因特性及抗原变异情况,为甲型H1N1流感防控提供科学依据。方法:采集2009年8月-2011年3月闵行区哨点医院流感样患者鼻咽拭子标本,Real-time RT-PCR鉴定流感病毒亚型,犬肾细胞(MDCK)培养分离流感病毒,血凝抑制试验(HI)确定流感病毒型与亚型。对部分甲型H1N1流感病毒株进行血凝素(HA)、病毒聚合酶(PB2)片段全基因测序,分析基因和氨基酸位点变异情况。结果:闵行区于2009年8月-2010年3月发生第一波甲型H1N1流感疫情,共报告甲型H1N1流感确诊病例232例,占流感病例总数的54.33%。2010年12月-2011年3月发生第二波甲型H1N1流感疫情,共报告甲型H1N1流感确诊病例71例,占流感病例总数的62.83%。HA进化树分析发现,第二波分离的甲型H1N1流感毒株与大多数2009年第一波大流行分离毒株不位于同一主干上,说明HA基因发生了一定程度的变异;HA蛋白氨基酸位点分析显示,部分毒株在抗原决定位点上发生了变异。PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和701位点分别是谷氨酸和天冬氨酸,仍为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点,但第677位点出现E677G突变。结论:2011年冬春季闵行区人群中甲型H1N1流感流行毒株与2009年北美流行株比较已经有一定变异,出现了一些抗原漂移和适应性进化。     

甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素HA1氨基端的表达及双抗体夹心ELISA法的建立

甲型H1N1流行性感冒（简称流感）病毒是一种人类最常见的流感病毒之一,2009年引起流感大流行的病毒并非一种全新的流感病毒[1],陆一涵等[2]推测可能是北美地区的H1N4病毒发生了一定程度的变异（包括重组和重排）所致。基因组测序发现,该病毒包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段[3-4],其中血凝素(HA)蛋白来源于猪谱系,一直存在于经典猪流感病毒和三源重排子猪流感病毒中[5]。HA蛋白是流感病毒最主要的表面抗原,与病毒吸附穿膜及宿主对病毒易感性有关[6-8],其变异率较高,常通过突变使病毒逃脱宿主免疫引起新的流感大流行。这种变异主要体现在HA1氨基端球形头部的受体结合部位与抗原决定簇氨基酸的改变,因此甲型H1N1病毒HA1氨基端蛋白的表达是建立特异性检测方法的关键。笔者通过原核表达此次甲型H1N1流感病毒血凝素HA1氨基端蛋白,制备多抗血清,建立了特异性双抗体夹心ELISA检测法。     

2017 - 2018年度陕西省甲型H1N1流感病毒基因特征分析

目的 了解陕西省2017 - 2018年度甲型H1N1流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因变异情况。方法 选取2017 - 2018年度分离的6株甲型H1N1流感毒株进行全基因测序,利用生物信息学软件对分离株的HA和NA基因进行进化和变异分析,并与北半球疫苗株A/Michigan/45/2015进行对比;采用MEGA（5.05） 软件NJ法构建基因进化树,进行系统进化分析。结果 陕西省2017 - 2018年度甲型H1N1流感病毒阳性占比36.85%,流行高峰为2017年12月和2018年1月。6株甲型H1N1流感病毒测序得到的HA、NA序列与疫苗株比对,分别有12、11个氨基酸位点发生变异,其中HA有7个位点变异发生在抗原决定簇,受体结合位点、潜在糖基化位点比较稳定;NA序列没有发现耐药位点变异。结论 2017 - 2018年度陕西省甲型H1N1流感病毒为优势流行株。目前甲型H1N1流感病毒与WHO推荐的新疫苗株高度同源。     

输入性甲型H1N1流感病毒HA基因进化特征

目的分析输入性甲型H1N1流感病毒的HA基因进化特征,及早发现变异株。方法选取广东口岸入境人群中检出的53份输入性甲型H1N1流感阳性样本,扩增其病毒HA基因并测序,与2009年甲型H1N1流感代表株A/California/04/2009/H1N1比较,对甲型H1N1流感病毒的HA基因进行系统进化分析。结果 HA基因进化树可分为4个分支,2009年、2010年病毒共同位于第Ⅰ、Ⅱ分支,2011年病毒位于第Ⅲ、Ⅳ分支,其中第Ⅰ、Ⅱ分支与Ⅲ、Ⅳ分支距离较远。HA核苷酸序列有11个碱基位点变异较为显著。HA蛋白5个抗原决定簇位点S202T、A203T、D204N、S220T和R222K发生变异,受体结合位点、糖基化位点氨基酸较保守。通过三维构象看出,大部分氨基酸变异位于HA1分子表面。结论甲型H1N1流感病毒HA基因已发生一定程度的变异。随着突变的不断积累,病毒极可能会通过改变其抗原性,从而引起新的流行。     

福州市2010年甲型H1N1流感病毒分离株血凝素基因分子进化分析

目的 了解福州市2010年甲型H1N1流感病毒HA基因的突变和分子进化.方法 采用RT-PCR技术扩增流感病毒A/Fuzhou/2/2010(H1N1)血凝素HA基因,测定核苷酸序列,用Clus-talX 1.83软件进行序列比对,用Bi0edit软件的ClustaW程序进行序列同源性分析,用Mega 5.0软件以邻位...     

2009年安康市甲型H1N1流感实验室检测结果及流行病学分析

目的通过分析安康市流感检测结果,以确认下一步甲型H1N1流感防控工作。方法采集病例咽拭子或鼻咽拭子标本用Real-time PCR方法进行甲型H1N1流感病毒核酸检测。结果从2009年8月27日到12月31日止,共接受399例疑似甲型H1N1接受筛查的病例中,共有53例(13.3%)被确诊为甲型H1N1流感,12例(3.0%)被确认为季节性流感(H1、H3型),其他型77例(19.3%)。结论安康市甲流确诊病例以学生为主,暴发疫情的主要场所为学校。建议继续加强对流感的监测工作和对监测数据的分析利用,根据疫情进展情况适时间调整甲流防控措施。     

四川省成都市甲型H1N1流感血清学调查结果分析

目的了解成都市人群甲型H1N1流感感染现状。方法按照国家方案采集不同年龄组人群血清标本,用血凝抑制(HI)试验方法进行抗体检测,HI抗体滴度≥1∶40判为阳性。结果成都市甲型H1N1流感阳性率8.85%(108/1221);13～17岁组阳性率最高(13.85%,P0.05);男女性阳性率差异无统计学意义;就诊人群阳性率低于一般人群,但差异无统计学意义。结论成都市发生了甲型H1N1流感社区流行,但在人群中的自然感染未形成有效免疫屏障,甲型H1N1流感疫苗接种仍有必要。     

四重RT—PCR快速检测2013新型H7N9禽流感病毒

目的建立能快速准确检测发热病人咽拭子样本中2013新型H7N9禽流感病毒的四重RT—PCR方法。方法针对甲型流感病毒的M基因设计通用引物,针对2013新型H7N9禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物,选择人源看家基因beta—aetin设计质控引物,通过优化实验条件建立一步法四重RT—PCR反应体系。与商品化实时荧光RT—PCR试剂盒进行方法比对。结果成功建立四重一步法RT—PCR筛查2013新型H7N9禽流感病毒的检测技术。结论该方法简便、实用、成本低廉,适用于2013新型H7N9禽流感病毒的快速检测。     

2000—2007年佛山市甲1亚型（H1N1）流感病毒监测情况及其HA1基因的变异

目的分析2000—2007年佛山市甲1亚型（H1N1）毒株流行情况及其HA1基因变异情况。方法用MDCK细胞分离流感病毒，采用血球凝集抑制试验进行型别鉴定，选取每年2～4株甲1亚型毒株的细胞培养物提取病毒核酸，进行HA1基因的逆转录，对其核苷酸和氨基酸序列及亲缘关系进行分析。结果病毒分离结果显示2000—2007年间甲1亚型流感病毒在佛山市人群中的流行是间断性的，只在2000、2001、2005、2006年4个年份分离到甲1亚型流感毒株。毒株的HAl区氨基酸序列与流感疫苗推荐株A／NewCMedonia／20／99和A／Solomon Islands／3／2006相比，同源性分别为97．2％～99．7％和97．2％-98．5％。氨基酸残基平均替换数随年份的推移而增加，只有2006年的毒株在抗原决定簇发生了替换。结论与疫苗株比较，佛山市的甲1亚型流感毒株抗原性已逐渐发生了改变，应密切注意疫苗对毒株的免疫效果。     

珠海市甲型H1N1流感患者经济负担分析

目的了解珠海市甲型H1N1流感流行期间患者的经济负担状况。方法对珠海市甲型H1N1流感流行期间流感监测系统发现的甲流病例及甲流肺炎病例进行问卷调查,内容包括病例疾病情况、就诊费用情况及其他相关费用等情况,结合流感监测数据估算患者经济负担。结果研究共随访到甲型H1N1流感门诊病例490例,肺炎住院病例20例。门诊患者就诊费用平均为289.03元,中位数200.00元(IQR:200.73,P25=100.80,P75=301.53);其他费用平均为45.83元,中位数20.00元(IQR:33.00,P25=8.00,P75=41.00);总的花费平均为334.86元,中位数308.00元(IQR:289.40,P25=130.60,P75=420.00)。肺炎住院病例的花费为2 831.29元,中位数2 660.00元(IQR:1 286.00,P25=2 000.00,P75=3 286.00)。估计珠海市2009年6月-2011年5月甲型H1N1流感流行期间,全市甲流门诊病例和住院病例总经济负担约4 992.48万元。结论珠海市甲型H1N1流感门诊就诊和肺炎住院病例经济负担较重。     

2007-2008年吉林省H3N2亚型流感病毒HA1基因序列分析

目的了解2007-2008年间吉林省H3N2亚型流感病毒HA1基因的演变特征。方法采用MD-CK细胞分离培养流感病毒,提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链式反应扩增后测序。结果①2007-2008年吉林省流行的H3N2亚型流感毒株核苷酸同源性为98.9%～100%,与同期WHO推荐的疫苗株A/Wisconsin/67/05相比有10～14个氨基酸位点发生变化,并且在122位增加了一个糖基化位点;②长春市11月与12月分离的病毒株在进化树上处于不同的两个侧枝;③在同一流行高峰吉林省8个市州分离的流感病毒株在进化树上形成不同的两簇。结论2007-2008年吉林省流行的H3N2亚型流感毒株与WHO推荐的疫苗株A/Wisconsin/67/05相比已经发生一定变化;不同时间及市州流行的病毒株也有差异。     

沈阳市流行性感冒监测数据的早期预警效果

目的利用现有的流行性感冒(流感)监测数据,探讨流感早期预警指标及其在2009年甲型流感大流行中的预警效果。方法选用沈阳18所哨点医院门诊流感样病例既往监测数据,采用控制图法,建立预警线,对2009和2010年的流感样病例百分比(ILI%)数据进行拟合,并结合新甲型H1N1疫情和病原学监测结果综合分析其早期预警效果。结果控制图法显示,ILI%较病原学监测和大疫情数据提前1周超过警戒线,ILI%趋势于新甲型H1N1疫情、流感病毒检出率变化趋势基本一致。结论 ILI%作为流感活动的监测指标较为可靠,控制图法可作为流感大流行敏感有效的早期预警指标。     

2009甲型H1N1流感病毒的血凝素和神经氨酰酶基因变异分析

目的探讨2009新型甲型流感病毒H1N1的血凝素和神经氨酰酶基因的进化规律。方法通过NCBI数据库下载最新收录的A/H1N1的基因序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version4.0(MEGA4.0)软件来排列和修剪流感病毒各段基因序列并构建进化树。结果不同地区分离到的2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素和神经氨酰酶编码基因均具有高度同源性,同一国别的亲缘关系更近,不同国别的亲缘关系稍远。结论说明此次新型甲型H1N1流行病毒来自同一传染源,且病毒到目前还没有变异。     

甲型H1N1流感病毒real-time RT-PCR检测方法的研究与应用

[目的]建立一种特异、灵敏、快速的Real-Time RT-PCR方法用于检测甲型H1N1流感病毒核酸.[方法]采用WHO所推荐的引物与探针序列,对Real-Time RT-PCR反应体系和反应条件进行调整优化,检测该方法的特异性和灵敏度.并对疑似甲型H1N1流感病例咽拭子标本进行检测.[结果]该方法对甲型H1N1流感病毒的检测的灵敏度达10-7(HA滴度为1:128),可从疑似甲流感患者咽拭子中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右.[结论]建立的TagMan探针法Real-Time RT-PCR是一种检测甲型H1N1流感病毒的快速、特异、敏感的新方法,适合于基层疾控机构及医院开展甲型H1N1流感的应急检测.     

2009年绵阳市学校甲型H1N1流感疫情分析

目的了解绵阳市甲型H1N1流感疫情的流行病学特征,为制定防控措施提供依据。方法从中国疾病预防控制系统和现场调查资料中收集绵阳市学校甲型H1N1流感疫情的相关信息,采用描述性流行病学方法分析结果。结果 2009-09-01/09-30,绵阳市共有29所学校发现186例甲型H1N1流感确诊病例,无重症或死亡病例。其中,中学20所、小学4所、大中专院校4所、幼儿园1所。绵阳市城区及所辖6个县(市)均有甲型H1N1流感疫情发生。确诊病例平均年龄14.64岁,男∶女为1∶0.63。结论甲型H1N1流感已在绵阳市学校流行。