在铜绿假单胞菌临床分离株1类整合子中发现携带新型耐药基因盒

目的:研究铜绿假单胞菌中1类整合子的分布和结构特征及与多重耐药的关系.方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测铜绿假单胞菌1类整合酶基因(int Ⅰ)并扩增其可变区;DNA测序技术分析1类整合子可变区的耐药基因;对1类整合子阳性菌采用琼脂平皿稀释法测定其MIC并进行转移接合明确其耐药基因转移情况;脉冲场凝胶电泳法(PFGE)了解这些阳性菌的遗传相关性.结果:47株铜绿假单胞菌临床分离株中,29株携带1类整合子,未检测到3类整合子.这29株包含的整合子均扩增出长度约4.3 kb的可变区,核酸序列分析发现存在新型耐药基因盒组合形式aac(6')-Ⅱ-aadA13-cmlA8-oxa-10,Genbank基因号为EU182575.其中基因盒aadA13以往未在铜绿假单胞菌中发现.同时第3个开放阅读框与已知基因cmlA5有95%的同源性,为编码氯霉素外排泵的基因盒,将其命名为cmlA8.PFGE结果分析显示29株阳性菌株具有高度的同源性.结论:本院流行的铜绿假单胞菌携带包含新型基因盒及组合形式的Ⅰ类整合子,再次证实1类整合子参与了铜绿假单胞菌的耐药和多重耐药.     

347株铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的 分析2013年本院铜绿假单胞菌的感染分布和耐药情况,为临床合理应用抗菌药物提供依据。方法 采用Vitek2 Compact全自动微生物分析仪对细菌做鉴定和药敏试验,应用WHONET 5.4软件对数据进行统计分析。结果 2013年1-12月我院住院患者共分离铜绿假单胞菌347株,主要来源于下呼吸道标本,占68.6％;其次为分泌物,占23.3％。该菌对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、亚胺培南和妥布霉素的耐药率较低,为2.9％ ～8.6％;对复方新诺明、头孢替坦、头孢曲松、呋喃妥因、氨苄西林/舒巴坦、氨苄西林和头孢唑啉的耐药率较高,为93.7％ ～ 100％。结论 铜绿假单胞菌主要引起患者的下呼吸道感染,该菌耐药现象严重,应依据药敏结果合理用药,建议选择哌拉西林/他唑巴坦和头孢吡肟。     

1096株铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的了解院内感染铜绿假单胞菌的耐药性变化情况，为临床诊诒提供参考。方法收集2005—2006年我院各科临床标本，分离培养铜绿假单胞菌并做药敏鉴定，分析其耐药性的变化。结果共检出1096株铜绿假单胞菌。对抗生素的耐药率为美洛培南17．9％（196／1096），左旋氧氟沙星35．3％（387／1096），环丙沙星37．3％（409／1096），头孢吡肟65．6％（719／1096）。结论要加强对铜绿假单胞菌的耐药性检测并合理使用抗生素以延缓耐药菌株增加。     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组的初步注释

目的 对已完成测序的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组进行初步注释。方法 利用生物信息学软件和网上工具对噬菌体PaP3进行开发阅读框（Open reading frame,ORFs）检索；编码序列鉴定；对公共数据库进行BLAST查询，分析基因的可能功能；对存在高度同源性序列的推定蛋白进行多重序列比对和系统发生树分析。结果 利用生物信息学软件在PaP3基因组中检索到252个大于100bp的ORFs，其中有699个ORFs可确认为推定基因；核苷酸对核苷酸的BLASTn分析未发现有意义的同源性核苷酸序列；核苷酸对蛋白质的BLASTx分析共发现了4个在公共数据库中有高度同源性序列的ORFs，根据其同源性蛋白的功能推定ORF13052－14761编码产物为引物酶／解旋酶，ORF40280－41728编码产物为末端酶大亚单位，ORF41728－42225编码产物为溶菌酶，ORF16912－18549编码产物为DNA聚合酶；绘制出了上述这四种蛋白的系统发生树。结论 噬菌体PaP3具有252个大于100bp的ORFs，其中69个为推定基因，有4个推定基因的功能被确认为分别编码引物酶／解旋酶，末端酶大亚单位，溶菌酶及DNA聚合酶。     

168株铜绿假单胞菌感染的耐药分析

目的:了解临床各种标本分离的铜绿假单胞菌(PA)对抗菌药物的耐药情况,为临床正常选用抗菌药物和有效控制铜绿假单胞菌感染提供实验室依据。方法:采用微生物系统进行细菌鉴定。结果:铜绿假单胞菌对多种抗菌药物具有高度耐药性,复方新诺明的耐药率已高达96.8%、头孢呋辛钠96%、头胞曲松95%、头孢噻肟72%。结论:必须根据药敏结果合理选用抗菌物。     

86株铜绿假单胞菌的耐药特征分析

［目的］研究铜绿假单胞菌的耐药特征．［方法］采用美国临床实验室标准化委员会推荐的纸片 扩散法和 ＤＡＤＥ 公司的 Ｍｉｃｒｏ－Ｓｃａｎ仪器测定了对 ３年来初次分离的 ８６株铜绿假单胞菌对 ２０种抗生素 的耐药特征．［结果］铜绿假单胞菌对氨噻酸单胺菌素、氧哌嗪青霉素－他唑巴坦、氨苄青霉素－青霉烷 砜、甲氧苄氨嘧啶－磺胺甲基异■唑、硫酸丁胺卡那霉素、丙氟哌酸、头孢塔齐定、亚胺硫霉素的敏感率最 高,分别为８１．６％,９１．１％,８３．０％,８８．２％,９２．０％,８９．１％,６８．２％,９４．３％．而对氨苄青霉素、头孢唑 啉、噻吩甲氧头孢菌素、博拿霉素、头孢三嗪、呋肟头孢菌素、头孢噻吩、氧哌嗪青霉素高水平耐药,敏感 率为１０．９％～９．３％．［结论］氨苄青霉素－青霉烷砜、氨曲南、氧哌嗪青霉素－三唑巴坦、增效磺胺甲基异 ■唑、硫酸丁胺卡那霉素、丙氟哌酸、亚胺硫霉素对所分析的铜绿假单胞菌有较高的活性,是治疗铜绿假 单胞菌感染的最有效的抗生素     

120株铜绿假单胞菌的分布及耐药性分析

铜绿假单胞菌（PA）是医院内出现率最高的细菌，是许多严重感染，如下呼吸道感染、肺炎、菌血症、伤口感染等常见的病原菌，控制多重耐药的PA感染始终是临床治疗的难点，笔者就120株确诊的PA的分布和对抗生素的耐药情况进行了调查和分析。     

铜绿假单胞菌LCT-PA220菌株全基因组序列测定与分析

目的全基因组测序和分析铜绿假单胞菌LCT—PA220菌株,研究空间因素对细菌全基因组的影响,为宇航员的保健奠定基础。方法通过革兰染色鉴定LCT—PA220属性,提取基因DNA、构建文库并上机测序;加工处理原始测序数据后进行基因组组装、注释和分析。结果铜绿假单胞菌LCT—PA220菌株革兰染色阴性,基因组为6．87M,包括5829个编码序列,平均长度为962bp,预测到为54个tRNA基因,COG数据库和KEGG数据库比对共注释到22组COG功能和32条KEGG信号通路。结论铜绿假单胞菌LCT—PA220菌株全基因组测序和基因组清楚,为后续对该菌株的研究打下了基础。     

TREM-1在细菌性化脓性角膜炎中的作用及其分子机制

【目的】 探讨髓样细胞诱发受体1(TREM-1)在铜绿假单胞菌(PA)感染角膜炎中的作用及其分子机制。【方法】为了揭示TREM-1在细菌性角膜炎中的作用,我们建立了PA角膜炎小鼠模型和PA感染的腹腔巨噬细胞模型,real-time PCR和免疫荧光法检测感染前后TREM-1的表达水平;用丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的抑制剂或磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂预处理巨噬细胞,再用脂多糖(LPS)和TREM-1活化抗体刺激,real-time PCR检测IL-1β、MIP-2、TNF-α和IL-6等促炎因子的表达水平,进一步探讨TREM-1调控PA角膜炎的分子机制;用Th1细胞因子IFN-γ或者Th2细胞因子IL-4?IL-10刺激巨噬细胞,real-time PCR检测Th1/Th2细胞因子对TREM-1表达的调控。【结果】 PA感染的C57BL/6小鼠角膜中TREM-1表达高于BALB/c小鼠;体外研究显示PA感染和LPS刺激均诱导TREM-1高表达;TREM-1通过MAPK和PI3K-Akt通路调节促炎因子生成;Th1细胞因子促进TREM-1表达,而Th2细胞因子不影响TREM-1的表达。【结论】 PA 感染上调TREM-1的表达,TREM-1通过调控Th1/Th2细胞因子的表达进一步放大炎症,导致角膜溃疡穿孔,这一发现可能为化脓性角膜炎的防治提供了新的理论依据。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究

目的确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、裂菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性.方法对CsC1梯度离心纯化后的噬菌体PaP1颗粒进行电镜观察;提取PaP1基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;制备PaP1的单个噬斑,观察噬斑特点;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,37℃160 r/min培养3.5 h后测定噬菌体滴度;加入噬菌体及宿主菌使MOI=10,37℃温育15 min后进行一步生长实验,于0时刻和每隔10min取样50 μl测定上清中噬菌体滴度.结果PaP1噬菌体头部呈多面体立体对称,直径约70 nm ,无囊膜,有一个约60 nm长的尾;PaP1噬斑直径约2mm,圆形透明;当MOI为0.01时PaP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;根据一步生长实验结果绘制出了一步生长曲线.结论PaP1属于肌尾科裂菌性噬菌体,其基因组为双链DNA分子;最佳感染复数为0.01,感染宿主菌的潜伏期是20 min,爆发期是40 min,平均爆发量约为65.     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的　确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法　电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果　噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论　PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3 4     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的密码使用偏嗜性与tRNA基因

目的 检索分析铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的遗传密码使用偏嗜性及其tRNA基因的关系。方法 利用生物信息学软件和网上生物信息学工具，检索分析PaP3的遗传密码使用偏嗜性；并与铜绿假单胞菌PAO1的遗传密码使用偏嗜性进行对比分析；检索PaP3基因组中tRNA基因并分析其与遗传密码使用偏嗜性的关系。结果 传密码偏嗜性分析发现噬菌体PaP3和铜绿假单胞菌优势码一致的氨基酸有F－uuc,I-auc,V-guc,A-gcc,Y-uac,H-cac,N-aac,K-aag和T-acc；PaP3单独具有偏嗜性密码的氨基酸有A－gcu,G-ggu,T－acu和V-gua；铜绿假单胞菌PAO1单独具有偏嗜性密码的氨基酸有L－cug,V-gug,P-ccg,V-gcg,Q-cag,D-gac,E-gag,C-ugc,R-cgc,S-agc和G-ggc。tRNA基因查询发现了PaP3基因组中存在三段tRNA编码序列，分别编码tRNA^Asp,tRNA^Pro；它们的反密码子分别为“gtt”，“gtc”和“tgg”，分析结果没有表明这三个tRNA基因与优势转运氨基酸有关。结论 铜绿假单胞菌PAO1的遗传密码偏嗜性更为明显，而PaP3的遗传密码偏嗜性相对较弱，两者在遗传密码偏嗜性方面并未表现出一致性；噬菌体编码的tRNA基因与遗传密码偏嗜性之间有直接联系。     

Effect of Carbenicillin on Pseudomonas aeruginosa

The activity of carbenicillin against 200 strains of Pseudomonas aeruginosa was measured by a quantitative agar dilution method. Minimal inhibitory concentrations (M.I.C.'s) for five graded inocula were measured in terms of complete inhibition (CI) and reduced growth (RG). The M.I.C. decreased progressively as inocula were reduced, median values for the 200 strains ranging from 100 to 37.5 μg. per ml. by the CI criterion, and from 75 to 25 μg. per ml. by the RG definition. Ratios of M.I.C. obtained for large and small inocula were usually small. Identical M.I.C.'s by both CI and RG criteria were most often obtained when the inoculum for the RG criterion was 1 or 2 logs higher than that for complete inhibition.

Population analysis of 15 strains of Ps. aeruginosa showed that one specific drug concentration usually caused a sharp drop in proportion of viable cells, ranging from 3 to 5 logs. None of the populations were completely non-viable even at 150 μg. per ml. There was evidence that the viability of different-sized populations was reduced disproportionately by carbenicillin.

Carbenicillin 300 μg. per ml. exerted appreciable bactericidal effect against nine of 15 strains of Ps. aeruginosa after a 24-hour contact period; after only six hours the bactericidal effect was very small.

Quantitative sensitivity measurements for carbenicillin should include M.I.C. values for both CI and RG criteria, using a range of inocula for testing. Such M.I.C. values may well be useful in monitoring carbenicillin therapy of tissue infections.

     

铜绿假单胞菌Quorum-Sensing系统中rhlR基因的克隆表达及其免疫保护性研究

目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。