MK-801拮抗水杨酸钠致螺旋神经节细胞损伤的实验研究

目的探讨非特异性阻断NMDA受体拮抗水杨酸钠对离体培养螺旋神经节细胞兴奋性损伤的作用。方法将培养的耳蜗螺旋神经节细胞随机分为3组,分别为正常对照组:培养液中仅加入1mM谷氨酸;水杨酸钠组:1mM谷氨酸+5mM水杨酸钠;MK-801组:50μM MK-801+1mM谷氨酸+5mM水杨酸钠。培养24h后加药物干预3h,收集细胞采用实时荧光定量PCR及免疫荧光技术检测BDNF exonⅣ,BDNF exonⅥ转录及Caspase-3mRNA转录和蛋白表达的改变,研究应用MK-801非特异性阻断NMDA受体拮抗水杨酸钠对离体培养螺旋神经节细胞兴奋性损伤的作用。结果水杨酸钠组较谷氨酸组及MK-801组螺旋神经节细胞中BDNF exonⅣ,BDNF exonⅥ和Caspase-3 mRNA的转录及Cas-pase-3蛋白的表达水平显著增高(P值均<0.05);BDNF exonⅣ的转录在MK-801组较谷氨酸组明显降低(P<0.05);BDNF exonⅥ的转录在MK-801组较谷氨酸组未发生具有统计学意义的改变;Caspase-3的转录及蛋白的表达在MK-801组较谷氨酸组显著提高(P<0.05)。结论非特异性阻断NMDA受体能拮抗水杨酸钠引起的离体培养螺旋神经节细胞中BDNFexonⅣ,BDNFexonⅥ及Caspase-3上调。     

N L R P3炎症小体激活对水杨酸钠诱导大鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤的作用

目的 通过研究NLRP3炎症小体在大鼠耳蜗中的激活,探讨水杨酸钠诱导螺旋神经节神经元(SGN)损伤的关键分子机制.方法 64只SD大鼠随机分为4组:对照组(腹腔注射等量生理盐水)、人工外淋巴液(artifieial perilymph fluid,APL)组(左耳圆窗注入APL后,腹腔注射生理盐水)、水杨酸钠(sodi...     

大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的定量观察

目的 为定量观察SASCO Sprague Dawley(SD)大鼠耳蜗蜗轴螺旋管(Rosenthal's canal)切片中螺旋神经节细胞的数量提供实验依据.方法 11只SD大鼠用于本实验研究,其中5只正常SD大鼠用于对照,另966只SD大鼠用于制备乌苯苷引起的螺旋神经节细胞损害模型.耳蜗样品制作耳蜗中轴半薄切片,常规甲苯胺蓝染色,对耳蜗各回蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞进行计数,计数结果采用方差分析检验.结果 一个完整蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量在底回末段多于耳蜗底回起始段和中回中段.与正常大鼠耳蜗螺旋神经带数量相比,1mM乌苯苷仅造成耳蜗底回的部分螺旋神经节细胞破坏,而10mM乌笨苷可破坏绝大部分螺旋神经节,乌苯苷引起的螺旋神经节破坏模式是从耳蜗底回逐渐向顶回发展.结论 计数耳蜗各回不同部位切片中的蜗轴螺旋管内螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的耳蜗螺旋神经节细胞定量分析方法.     

水杨酸钠对豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞核转录因子-κB蛋白表达的影响

目的：观察水杨酸钠对豚鼠螺旋神经节细胞核转录因子-κB（NF—κB）蛋白表达的影响。方法：将48只健康且耳廓反射正常的花色豚鼠随机分为4组（每组12只），采用免疫组织化学方法测定豚鼠内耳NF-κB蛋白表达。结果：水杨酸钠组螺旋神经节细胞NF-κB蛋白表达明显高于对照组（P＜0．01）、水杨酸钠加尼莫地平组（P＜0．01）及水杨酸钠加氯丙嗪组（P＜0．05）。结论：水杨般钠能促进豚鼠螺旋神经节细胞NF—κB蛋白表达；尼莫地平、氯丙嗪能使水杨酸钠引起的豚鼠螺旋神经节细胞NF-κB蛋白表达作用减弱。     

α2-肾上腺素能受体在水杨酸钠诱导大鼠耳蜗螺旋神经节神经元兴奋毒性中的表达变化

目的 观察α₂-肾上腺素能受体(α₂-adrenergic receptor, α₂-AR)在大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron, SGN)中的分布，以及水杨酸钠(sodium salicylate, SS)作用SGN不同时间点后α₂-AR各亚型的表达改变，以探讨其在SGN兴奋毒性中的作用。方法 将新生SD大鼠随机分成：对照组、SS处理6 h组、SS处理12 h组和SS处理24 h组，每组2只。急性分离各组SGN后进行原代培养48 h,对照组用新的培养基培养，不做处理，余三组分别用5 mM水杨酸钠处理6 h、12 h、24 h,用免疫荧光染色技术检测SGN中α₂-AR各亚型的表达情况；采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot方法检测SS作用不同时间后α₂-AR各亚型的mRNA和总蛋白表达改变情况。结果 (1)免疫荧光染色表明SGN上存在α_2A-AR、α_2B     

哇巴因对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的损伤

目的 观察哇巴因(ouabain)对SD大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SGC)的损伤.方法 75只雄性SD大鼠随机数字表法分为5组,除健康对照组外,其余4组经耳蜗鼓阶钻孔分别给予0.01、0.02、0.05 mmol/L哇巴因以及生理盐水.术后7d行畸变产物耳声发射(DPOAE)及听性脑干反应(ABR)测试;大鼠处死后取耳蜗组织,通过免疫组化和透射电镜观察耳蜗SGC形态学变化.体外分离培养孕14d胎鼠SGC,加入1×10-8mmol/L哇巴因,通过光镜和扫描电镜观察哇巴因对离体培养SGC的损伤.结果 鼓阶注入哇巴因后,大鼠DPOAE无明显改变,各组之间不同频率DPOAE幅值差异均无统计学意义(P值均＞0.05).耳蜗鼓阶注入哇巴因后,大鼠ABR 反应阈升高,且升高幅度随着哇巴因浓度的增加而加大;哇巴因组大鼠ABR阈值与生理盐水组及健康对照组相比,差异具有统计学意义(P值均＜0.05).电镜下哇巴因组大鼠SGC发生退行性改变,细胞器结构破坏,核膜溶解,神经髓鞘崩解、空泡化.哇巴因同样可导致离体培养SGC的损伤,胞体皱缩、变小,突起缩短、断裂,细胞结构破坏.结论 无论是在体还是体外细胞培养,哇巴因均可确切造成SGC损伤.     

过氧化氢体外诱导大鼠螺旋神经节细胞死亡机制的研究

目的:观察过氧化氢(H2O2)对大鼠螺旋神经节细胞(SGCs)的作用,探讨氧自由基损伤SGCs的机制.方法:新生大鼠SGCB原代培养,取培养第4天细胞加入H2O2,浓度分别为0、100、200、500μmol/L,作用2、4、6 h.光镜下观察细胞形态改变,hochest33258及PI染色,计数受损伤细胞的百分比.结果:在H2O2的作用下,原代培养的SGCs随着H2O2浓度的增加以及作用时间的延长,受损伤的细胞数目呈增加趋势.同时,低浓度(100及200 μmol/L)H2O2作用下,SGCs的损伤主要以凋亡表现为主,PI染色多为阴性;高浓度H2O2(500μmol/L)作用下的SGCs损伤以坏死为主.结论:H2O2可以引起SGCs凋亡,且作用有明显的剂量及时间依赖性.凋亡的发生可能和凋亡相关基因的启动有关,但仍需进一步实验证实.     

重组杆状病毒载体介导大鼠螺旋神经节细胞基因转染的研究

目的探讨重组杆状病毒（baculovirus，Bac）作为内耳螺旋神经节细胞基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统制备携带绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）的杆状病毒载体（Bac—GFP），以不同感染复数（multiplicities of infection，MOI）的病毒和不同浓度的丁酸钠转染大鼠螺旋神经节细胞，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞转染率和绿色荧光蛋白表达强度，并观察杆状病毒和丁酸钠对螺旋神经节细胞的毒性。结果杆状病毒可以高效转染螺旋神经节细胞，转染效率达77．69％。Bac—GFP转染率和表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而提高。GFP在转染后6h开始表达，第2天达到最高。重组杆状病毒MOI小于800以及丁酸钠终浓度小于或等于10mmol／L时，对螺旋神经节细胞没有明显细胞毒性。结论重组杆状病毒可以在体外高效安全转染内耳螺旋神经节细胞。     

水杨酸钠对幼年和成年豚鼠听性脑干反应阈值及螺旋神经节谷氨酸脱羧酶表达的影响

目的 观察水杨酸钠对幼年和成年豚鼠听性脑干反应(ABR)阈值以及螺旋神经节谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)表达的影响.方法 选择出生4 d的豚鼠40只和出生后1个月的成年豚鼠40只,分成4组(每组20只):幼年对照组,成年对照组,幼年水杨酸钠给药组[300 mg/(kg·d)],成年水杨酸钠给药组[300 mg/(kg·d)].给药15 d后每组随机选取10只豚鼠检测ABR阈值,采用免疫组织化学染色方法检测螺旋神经节GAD的表达.各组剩下的动物停止给药,继续喂养30 d后检测ABR阈值和螺旋神经节GAD的表达.结果 给药15 d后幼年水杨酸钠给药组和成年水杨酸钠给药组豚鼠ABR阈值较给药前以及同期对照组均有提高(P值均<0.001),停药30 d后幼年水杨酸钠给药组ABR阈值恢复到给药前水平,而成年水杨酸钠给药组仍停留在高阈值水平;水杨酸钠给药15 d后能明显下调幼年以及成年豚鼠螺旋神经节GAD蛋白表达,幼年豚鼠GAD表达水平低于成年豚鼠(t=4.7,P<0.001),停药30 d后幼年给药组螺旋神经节GAD表达恢复到同期对照组水平,而成年给药组则继续停留在低表达水平.结论 水杨酸钠在对幼年和成年豚鼠ABR阚值以及螺旋神经节GAD表达的影响上存在差异,其对幼年豚鼠的影响更为明显,但停药后幼年豚鼠较成年豚鼠更容易恢复到正常水平.     

小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育

目的研究小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育,探讨螺旋神经节神经元的发育成熟过程。方法应用透射电镜观察３２只１～６０天龄小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育。结果新生小鼠螺旋神经节神经元为形态相同的幼稚细胞,由卫星细胞及其伸出的单层突起包绕,无致密髓鞘形成;出生后７天,Ｉ型神经元出现,Ｉ型神经元局部致密髓鞘开始形成;出生后１０～１４天,Ｉ型神经元多层致密髓鞘出现;出生后３０天,可见一种细胞形态和Ｉ型神经元相似而有明显致密髓鞘的神经元;出生后６０天,螺旋神经节神经元髓鞘基本发育成熟。螺旋神经节神经元的发育成熟由底回向顶回逐步发展。结论出生后７～１４天是螺旋神经节神经元发育和成熟的重要阶段。     

特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立

目的：建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型,为研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。方法成年雌性SPF级CBA／J小鼠60只,随机分为实验组和生理盐水组,每组30只,实验组动物经圆窗渗透给予10μl哇巴因（ouabain）,生理盐水组同法给予等量生理盐水。每组于给药前及给药后7、14及30天分别检测小鼠听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）,并用免疫组织荧光技术和基底膜铺片技术分别观察耳蜗螺旋神经元（spiral ganglion neurons ,SGNs）细胞及内耳毛细胞（hair cells ,HCs）的变化。结果①与生理盐水组比较,实验组给药后各时间点 ABR反应阈均明显升高,波Ⅰ潜伏期延长,振幅明显降低,差异有统计学意义（ P＜0．05）。②实验组及生理盐水组小鼠DPOAE均可正常引出。③与生理盐水组相比,实验组耳蜗各回螺旋神经元的数量及密度显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。④实验组在给药后不同时间点,耳蜗各回内、外毛细胞均排列整齐、形态完整、未见明显损伤或丢失。结论哇巴因经圆窗渗透给药可特异性损伤CBA／J小鼠内耳螺旋神经元及其功能,而不损伤内、外毛细胞,是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。     

应用膜片钳技术对螺旋神经元放电类型的初步研究

目的：研究原代培养新生鼠螺旋神经元的放电类型。方法：应用膜片钳技术全细胞构型从原代培养的螺旋神经元获得电流钳记录。结果：从螺旋神经元记录到动作电位，螺旋神经元具有不一致的放电特征。结论：螺旋神经元具有快适应和慢适应两种放电特征，多数神经元为快适应神经元。     

庆大霉素对小鼠螺旋神经节神经元电生理特性的影响

目的 探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节神经元细胞电生理特性的影响及其意义。方法 应用全细胞电压钳技术研究庆大霉素对急性酶分离小鼠螺旋神经节神经元细胞膜上的钾、钠离子通道电流的峰值的影响．与细胞外液中庆大霉素浓度的关系，以及庆大霉素洗脱后电流的恢复情况。结果 庆大霉素能抑制电压依赖性钾通道，但不能抑制电压依赖性钠通道，其钾通道抑制作用与细胞外液中庆大霉素的浓度呈剂量依赖性，庆大霉素洗脱后电流恢复不完全。结论 庆大霉素通过抑制螺旋神经节神经元细胞的钾离子通道而产生耳毒性。     

Transient Bax-protein Immunoreactivity Prior to Apoptosis of Spiral Ganglion Neurons in the Postnatal Rat

The apoptosis occurring in the postnatal developing spiral ganglion cells (SGCs) and the concomitant change in Bax-protein immunoreactivity were investigated in rats at postnatal days (P) 1, 3, 5, 7, 10 and 14, and also in adult rats. In P5 and P7 rats, some neurons showed structural features of apoptosis, including cell shrinkage, condensed chromatin around the margin of the nucleus and phagocytosis of apoptotic bodies by satellite cells. The percentage of Bax-protein-positive neurons in the spiral ganglion was significantly higher in P1, P3, P5, and P7 rats compared with adult rats. Our results confirm the occurrence of neuronal cell apoptosis in the spiral ganglion at the end of the first postnatal week, and demonstrate the transient change in Bax-protein immunoreactivity prior to neuronal cell apoptosis. Thus, we speculate that the transient change in Bax protein could be involved in neuronal cell apoptosis of the postnatal developing SGCs of rats.     

卡铂对灰鼠螺旋神经节的早期损害

实验中观察了卡铂(50mg/kg)对灰鼠耳蜗螺旋神经节细胞的急性损害.注药后6小时即可发现在Ⅰ型神经元胞体和神经纤维中有空泡形成.注药后1天可见Ⅰ型神经元内充满大空泡并开始发生坏死.其结果表明卡铂产生对螺旋神经节的毒害相当迅速.提示耳蜗传入神经系统可能是卡铂的第一个靶组织.     

大鼠出生后发育中螺旋神经节神经元凋亡的观察

目的：研究大鼠出生后发育时螺旋神经节（spiral ganglion,SG）神经元凋亡和分化的关系。方法：应用透射电镜观察1、3、5、7、10、14和30天龄大鼠螺旋神经节神经元超微结构的变化及细胞凋亡现象。结果：大鼠出生后5和7天，在透射电镜下观察到SG神经元凋亡，其典型的超微结构改变为染色质凝聚和着边形成的新月样结构、凋亡小体和细胞皱缩；随后的发育阶段细胞凋亡现象消失；最早可识别的富含神经丝的Ⅱ型神经元（neuron2,N2）出现在出生后7天，新出现的N2有明显的细胞皱缩现象；在随后发育的各阶段，SG中I型神经元（neuron1,N1）和N2的结构特征更明显，逐渐发育成熟。结论：神经元凋亡是大鼠螺旋神经节出现后发育过程中的一个重要事件，发生在N2分化过程中，可能与SG中N2发育有关。     

应用LsAB技术显示五羟色胺受体亚型1A在小鼠螺旋神经元上的分布

目的显示五羟色胺（serotonin,5-HT）受体亚型1A在螺旋神经元上的分布。方法采用出生后3～6天的乳小鼠耳蜗进行冰冻切片,应用酶标链亲和素-生物素（labeled streptavidin-biolin technique,LsAB）技术显示五羟色胺受体亚型1A在螺旋神经元上的分布。结果实验组的乳鼠耳蜗螺旋神经元的细胞膜显示阳性信号,阴性对照组的乳鼠耳蜗螺旋神经元的细胞膜上未发现阳性信号。结论五羟色胺受体亚型1A存在于耳蜗螺旋神经元的细胞膜上,推测当毛细胞释放兴奋性神经递质引起螺旋神经元兴奋时,五羟色胺作为神经递质对螺旋神经元的听觉传导活动起着重要的调节作用。     

顺铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3活化的研究

目的：探讨顺铂的耳毒性作用与螺旋神经节细胞（sprial glanglion cell,SGC)凋亡的关系，及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法：取40只听力正常的豚鼠，随机分为顺铂1、2、4天组和对照组，每天检测听性脑干反应（ABR）和40Hz相关电位以观察豚鼠高，低频的听阈变化，并用TNEL法检测凋亡细胞数量变化，免疫组化检测SGC中Caspase-3p20活性片段的表达。结果：随着注射顺铂时间的延长，豚鼠听力逐渐下降，同时SGC的TUNEL染色明显增强，Caspase-3p20活性片段的表达增高，与对照组比较均有显著性差异（P＜0．01），结论：顺铂的耳毒性损害机制与SGC的凋亡有关；顺铂所致的SGC凋亡过程中有Caspase-3p20的激活。     

Expression Profile of Fas-Fas Ligand in Spiral Ganglion Cells During Apoptosis

Objectives

To examine the expression profile of Fas-Fas ligand (FasL) during glutamate (Glu)-induced spiral ganglion cell (SGC) apoptosis.

Methods

Cultured SGCs were treated with 10-mM, 25-mM, and 50-mM concentrations of Glu and incubated for 24 or 48 hours. The expression intensity of FasL, Fas, caspase 3, and morphology of single SGC were evaluated using immunofluorescence staining.

Results

In semiquantitative analysis of the Glu-treated SGC, FasL, and caspase 3 expression intensity were increased with concentration- and time-dependent manner. Fas expression intensity did not change with different concentration at 48 hours. In morphologic analysis of the Glu-treated SGC, number of apoptotic cells were increased with concentration- and time-dependent manner.

Conclusion

FasL was expressed in apoptotic SGCs, suggesting that the Fas-FasL signaling pathway may be involved in the Glu-induced apoptosis of dissociated SGCs.