贵州省死亡病例1型猪链球菌的分离及分子生物学特征分析

目的 对来自贵州省1例疑似人感染猪链球菌患者的血液标本进行细菌分离鉴定,了解该菌株的分子生物学特征,为病例的快速确诊提供病原学依据。方法 采用血培养法对疑似感染猪链球菌患者的血液进行细菌分离培养,对分离菌株采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增和DNA序列测定,将测序结果通过GenBank数据库的BLAST程序进行在线比对,再用猪链球菌种特异的16S rRNA 基因进行猪链球菌种的鉴定,进一步分别采用PCR检测常见强致病性血清型1、2、7和9型特异的cps 1j、cps 2j、cps 7h和cps9h基因以鉴定其血清型,并对菌株毒力基因gapdh、mrp、sly和ef进行检测。结果 血培养分离出1株链球菌可疑菌株,序列比对结果显示该分离菌株16S rRNA基因与猪链球菌的同源性最高,进一步的猪链球菌特异性PCR检测显示分离菌株16S rRNA基因为阳性,血清型特异PCR检测结果显示cps 1j基因为阳性,而cps 2j、cps 7h和cps 9h基因为阴性,毒力基因检测结果显示分离菌株gapdh,sly和ef毒力基因为阳性,而mrp为阴性。结论 本次从疑似感染猪链球菌死亡病例分离的菌株为猪链球菌1型,其毒力特征为gapdh、sly和ef基因阳性,mrp基因阴性,该病例为1型猪链球菌感染所致,且菌株毒力较强。     

2016年泰州市2起流感疫情的病原学检测及血凝素基因特征分析

目的 对泰州市连续发生的2起呼吸道疫情进行病原学检测和血凝素基因特征分析。方法 采集样本进行PCR快速检测,选取PCR阳性样本进行病毒分离鉴定,从中选取典型病毒培养物进行HA基因序列测定,并进行相关生物信息学分析。结果 样本核酸检测17例B型流感病毒核酸阳性,阳性率70.8％,阳性样品经病原学鉴定为B型Victoria系流感病毒,流感毒株HA基因与该市近期常规监测的Victoria 系毒株、北半球乙型流感疫苗株和来自美国的南半球代表株同源性高,而与该市2007年代表性分离株相比发生很大程度变异。结论 这2起流感疫情均由B型Vicoria系流感病毒引起,泰州市B型流感病毒HA基因暂处于稳态,应加强动态监测。     

抗-HCV阳性血清HCV RNA检测与基因分型的研究

目的 检测抗-HCV阳件血清巾的HCV RNA并进行HCV基因分型.方法 采用荧光定量PCR法检测85例大连地区抗-HCV阳性患者血清中HCV RNA,应用型特异性引物逆转录套式PCR法对HCV RNA阳性样本进行基因分型.结果 85例的抗-HCV阳性患者中,HCV RNA阳性65例(76.5%),其中基因分型1b型32例(49.2%),2a型29例(44.6%),未分型4例(6.2%).结论 抗-HCV阳性并非HCV直接标志,大连地区HCV基冈1b型和2a型基本相等.     

检测SARS冠状病毒的套式RT-PCR方法的建立与初步应用

[目的]建立套式RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法。[方法]从广东地区SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及本实验室分离的SARS冠状病毒（SAPS—CoV）组织培养上清中提取RNA，利用针对SARS冠状病毒多聚酶基因的特异性引物，进行逆转录及套式PCR扩增。扩增出的阳性片段连接入pGEM—T载体中，测序后比较其与其他已知SARS冠状病毒的同源性。[结果]从SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及SARS冠状病毒组织培养上清中均可扩增出阳性片段，经测序后证实是SARS冠状病毒特有序列。[结论]针对SARS冠状病毒多泵酶基因所建立的套式RT—PCR方法适用于临床标本及组织培养标本中SARS冠状病毒的检测。     

南京市一起斯坦利沙门氏菌食物中毒的病原学检测及溯源分析

目的 对食物中毒事件中所采集样本进行食源性致病菌的分离鉴定,快速查明食物中毒原因并进行同源性分析。方法 应用实时荧光PCＲ技术对一起食物中毒10份可疑食品、2份餐具涂抹样和5份患者粪便进行检测,同时进行病原菌培养分离鉴定,分离菌株采用CLSI 推荐的改良K-B纸片法进行抗生素敏感试验,应用PFGE分型技术进行同源性分析。结果 1份可疑食物和3份患者粪便经实时荧光PCR检测为沙门菌阳性,同时分离到4株斯坦利沙门氏菌,4株沙门氏菌的药敏试验结果一致,PFGE 带型完全一致。结论 本次食物中毒是由斯坦利沙门氏菌污染引起。实时荧光PCR技术能够快速准确地对食物中毒做出病原学诊断,PFGE基因分型技术可对病原菌进行溯源分析,对研究病原菌流行病学规律具有重要意义。     

某巡逻船聚集性诺如病毒疫情的病原基因特征分析

【目的】对浙江省岱山县2022年2月一起罕见的重组型诺如病毒暴发疫情进行病原学鉴定及基因分子特征分析。【方法】采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法对送检的8份肛拭样本进行诺如病毒病原学鉴定,用普通逆转录PCR(RT-PCR)对阳性样本基因扩增,用MEGA7.0及Simplot软件对扩增序列进行基因特征分析。【结果】送检的8份标本鉴定结果均为诺如病毒GⅠ型,基因特征分析为重组诺如病毒GⅠ.6[P11]亚型,重组位点位于ORF1-ORF2连接处。同源性最高（98.75%）的是2018年登录的GⅠ.6[P11]毒株序列（登录号：MT357995）。【结论】经病原学鉴定与基因特征分析,本次暴发疫情是由罕见重组型诺如病毒GⅠ.6[P11]亚型引起。     

用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因

目的 应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法直接从临床麻疹患者的咽拭子及尿液中检出570bp的特异性H基因目的条带。方法 采集临床确诊为麻疹商例的咽拭子、尿液提取RNA，用RT－PCR方法扩增麻疹病毒血凝糖蛋白的570bp核苷酸片段。结果 22例病人的20份咽拭子样品中，均检测到相应条带，20份尿液中有18份检测到相应条带；采用RT－PCR一次扩增的产物，检测灵敏度即达到0.001 TCID50。结论 麻疹病人唾液样本的RT－PCR阳性率高于尿液，该方法可用于麻疹的病原学的快速辅助诊断，特别是对出疹初期就诊的临床符合，但麻疹IgM阴性的病例可进行进一步确诊。     

1例不明原因肺炎病例密切接触者的病原学诊断与分析

目的 对1例出现流感样症状的不明原因肺炎病例密切接触者进行病原学诊断,分析实验室诊断过程应关注的问题.方法 采集该病例的咽拭子标本,应用荧光PCR方法检测H5N1病毒、甲型H1N1和季节性流感病毒,多重PCR方法检测12种常见的呼吸道病毒.同时接种Hep-2细胞进行病毒分离,采用PCR方法扩增病毒的基因片段,进行序列比对分析.并应用间接免疫荧光方法检测病人急性期血清IgM抗体.结果 荧光PCR方法检测H5N1病毒、甲型H1N1和季节性流感病毒核酸阴性,多重PCR检测到标本为腺病毒核酸阳性.应用Hep-2细胞分离到病毒,hexon基因序列比对结果显示,该病毒与GenBank数据库中的11a型腺病毒hexon的核苷酸序列同源性99.9％.间接免疫荧光反应还检测到病人的腺病毒IgM抗体阳性.结论 此不明原因肺炎病例密切接触者为11a型腺病毒感染.另外,除考虑SARS-CoV,H5N1外,不明原因肺炎病例的实验室诊断还应关注其他导致重症肺炎的呼吸道病原体.     

某市基地实验室新型冠状病毒核酸检测系统的性能评价

目的 评价某市核酸检测基地新型冠状病毒核酸检测系统的性能，以保证核酸检测结果的可靠性。方法 采用强阳性、弱阳性性能验证参考品及临床阴性样本对核酸检测系统的符合率、精密度、检测限和特异性进行验证。结果 符合率验证实验中，5份不同浓度阳性参考品检测结果均为阳性，5份阴性样本检测结果均为阴性，总符合率为100%；精密度验证实验中，强阳性和弱阳性参考品的ORF1ab基因批内精密度CV值分别为0.43%和1.31%，批间精密度CV值分别为0.56%和1.40%，强阳性和弱阳性参考品的N基因批内精密度CV值分别为1.19%和1.35%，批间精密度CV值分别为1.38%和1.47%，所有靶标精密度CV值均<5%；检测限验证实验中，弱阳性参考品重复测定20次的检出率均为100%；特异性验证实验[对加入严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒、中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒、冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒NL63型、H1N1流感病毒、乙型流感病毒、鼻病毒混合质粒的5份阴性标本检测]中，新型冠状病毒核酸检测结果仍旧均为阴性。结论 该新型冠状病毒核酸检测系统的各...     

荧光定量PCR方法快速检测人博卡病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的、用于人博卡病毒核酸检测的荧光定量PCR方法。方法对博卡病毒的ns1基因应用Clustal W软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针,并对荧光PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,并将该方法与国际上通用的针对人博卡病毒ns1基因和np基因的普通PCR方法进行灵敏度比对;同时将该方法应用于疑似患者临床标本检测。结果该方法针对ns1基因进行扩增,对人博卡病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、3型,甲型、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,腺病毒,冠状病毒229E、OC43,偏肺病毒以及鼻病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度均比国际上通用的扩增ns1基因及np基因的PCR方法高10倍。用该方法从144份急性上呼吸道感染患者咽拭标本中检出了2份博卡病毒阳性,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右;用普通PCR仅能检出1份阳性标本,且耗时需5 h左右。结论该研究建立的TaqMan荧光定量PCR是一种快速检测人博卡病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

一起外轮群体性甲型H1N1流感病例的实验室检测及分析

目的分析、溯源一起外籍船员群体性流感的原因。方法结合流行病学调查结果,采集所有船员的鼻咽拭子,处理后利用实时荧光PCR法对样本进行甲型流感、乙型流感、禽流感、甲型H3N2流感及新型甲型H1N1流感的检测;同时对所选样本进行RT-PCR确证检测及HA基因测序分析并构建分子进化树。结果实时荧光PCR检测结果显示,6例患者的甲型流感病毒及新型甲型H1N1流感病毒检测均为阳性,但均未检出乙型流感、禽流感及甲型H3N2流感病毒;RT-PCR确证实验以及HA基因测序结果也表明为新型甲型H1N1流感病毒阳性。结论引起本次群体性流感事件的原因为新型甲型H1N1流感病毒感染。分子进化分析表明,引起本次流感事件的病毒株与从香港分离得到的病毒株属同一分支。     

2010年信阳市手足口病实验室检测结果分析

目的 分析2010年信阳市手足口病实验室检测结果,明确2010年信阳市手足口病原学特征,为制定预防控制措施提供依据.方法 采集2010年信阳市各县区（市）送检的手足口患者的425份各类样本,应用RT-PCR技术和荧光PCR技术检测样本中的肠道病毒71型(EV71),柯萨奇病毒A组(CA16).结果 425份各类样本中,...     

深圳口岸国际旅行人员中HIV-1感染者耐药基因型检测分析

目的对深圳口岸1996—2008年已确诊的68例人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染者进行耐药性突变分析,以了解深圳口岸国际旅行者HIV-1耐药性毒株的流行情况。方法应用巢式RT-PCR扩增HIV-1聚合酶基因,对所获得的PCR产物直接测序,再将所获得的序列与国际耐药数据库比对,辨别耐药性突变位点。结果在68例HIV-1感染者中,经巢式RT-PCR扩增并获得聚合酶基因序列68份。耐药分析结果表明,本研究人群未检测到蛋白酶抑制剂(PI)原发耐药突变;11例感染者发生反转录酶抑制剂(RTI)耐药基因突变,基因突变率为16.17%;其中核苷类和非核苷类反转录酶抑制剂的耐药突变率分别为7.35%(5/68)和8.82%(6/68)。结论本研究分析了深圳口岸国际旅行者HIV-1感染者耐药突变的流行情况,这对于我国的艾滋病预防和控制工作具有重要指导意义。     

H7N9禽流感病毒重组质粒构建及应用

目的构建一种含H7N9禽流感病毒全长血凝素/神经氨酸酶/基质蛋白（HA/NA/M）基因的重组质粒,为核酸检测方法提供一种通用的阳性定量标准品。方法设计H7N9禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H7N9禽流感病毒总RNA后用实时荧光定量PCR获得相应片段,用3次酶切连接方法,依次插入到pGEM-T easy质粒,进行测序确认;线性化后的重组质粒用T7 RNA聚合酶进行体外转录,RNA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果HA、NA和M基因扩增片段大小分别约为1.7、1.3、1.1 kb,与预期相符;构建的重组质粒pGEM-HA-NA-M插入片段的测序结果与GenBank 公布序列一致;由重组质粒体外转录获得同时含有H7N9禽流感病毒HA、NA、M全长开放阅读框序列的RNA片段质量浓度为399.5 ng/μL,梯度稀释后用3种实时荧光定量PCR方法均获得了良好的标准曲线。结论成功构建重组质粒pGEM-HA-NA-M,由此质粒体外转录获得的RNA片段可作为H7N9禽流感病毒核酸快速检测方法通用的阳性定量标准品。     

广东省东莞市2010年首例输入性登革热病毒核酸检测及分析

目的:对广东省东莞市2010年首例输入性登革热疑似病例的标本进行快速诊断分型并对其部分核酸序列进行测序分析。方法:采用RT-PCR、PCR、基因测序技术对血清标本中的核酸进行检测分析,同时用ELISA法检测IgM抗体。结果:RT-PCR结果表明标本为Ⅰ型登革热病毒,对PCR扩增产物测序得到了包含衣壳蛋白基因和部分膜蛋白基因的455 bp长度的序列,经Blast比对发现与马来西亚的一株登革热病毒序列(GenBank号FN429890.1)相比,仅有一个C→T核酸差异,氨基酸水平无差异。IgM抗体检测为阳性。结论:PCR技术可方便快捷的用于登革热病毒的检测及分型,同时对扩增产物测序还可了解其相应的基因变异情况。流行病学结合实验室数据表明此病例为一输入性病例。     

2011-2013年济南市发热伴血小板减少综合征流行病学及病原学特征分析

目的分析济南市2011-2013年发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS）的流行病学特征和病原学特性,为更好地预防和控制SFTS提供科学依据。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法检测济南市2011-2013年SFTS疑似病例急性期血清样本和蜱虫样本中的SFTS布尼亚病毒核酸,采用RT-PCR方法进行扩增并测序,使用DNASTAR和MEGA软件对测序结果进行序列比对和进化分析;用描述性流行病学方法对监测数据进行统计分析。结果 2011-2013年济南市共确诊95例SFTS病例,检测出3只蜱虫样本中的SFTS布尼亚病毒核酸阳性;发病地区主要集中在章丘市。对SFTS布尼亚病毒的S片段基因进行测序,结果显示2012年SFTS布尼亚病毒基因与安徽、江苏、河南分离株遗传距离相对较近。2013年SFTS布尼亚病毒基因与山东本地分离株遗传距离相对较近。结论济南市发热伴血小板减少综合征病例以新布尼亚病毒为其主要病原;夏秋季多发;中老年农民为主,具有明显职业性;发病范围逐年扩大,局部地区疫情活跃。应加强传染源的管理控制,深入开展对高危人群宣传教育和行为干预。     

东莞市HIV-1主要毒株基因分型及其对耐药影响的研究

目的 了解东莞市人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）感染者流行毒株基因亚型的分布特征及耐药情况。方法 收集2015年10月至2016年2月东莞市疾病预防控制中心未经抗病毒治疗的50例HIV感染者血浆,提取病毒RNA,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增pol基因序列并测序,应用BioEdit、Genotyping和MEGA等生物学软件对pol基因进行HIV-1基因亚型分析,并将获得的核酸序列提至美国斯坦福大学HIV耐药数据库（http：//hivdb.stanford.edu）进行耐药位点分析。结果 50例样本最终成功扩增得到35份样本的pol基因序列,在这35例研究对象中,88.6%（31/35）为男性,65.7%（23/35）为经性接触感染。35条pol基因序列中,CRF01_AE亚型占37.1%（13/35）,CRF07_BC亚型占37.1%（13/35）,B亚型占14.3%（5/35）,CRF55_01B亚型占11.4%（4/35）。在35条基因序列中检测到11条（占31.4%）含有耐药相关突变,以CRF01_AE和CRF55_01B重组亚型为主,原发性耐药率为11.4%（4/35）。结论 东莞市HIV-1感染者存在着多种基因亚型,以CRF01_AE和CRF07_BC重组亚型为主,基因序列发生原发耐药性,应引起重视。     

分子生物学方法在儿童流行性感冒监测中的应用

目的：建立一种能够快速，特异，有效地直接从临床标本中检测流行感冒（流感）病毒并进行病毒型和亚型鉴别的方法，同时了解近年来北京地区A3型流感病毒因凝素重链（HA1）区基因的变异特点。方法：根据编码A、B型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，用于同一逆转录（RT）－PCR反应中（多重RT－PCR），根据A、B型毒株扩增产物的大小（分别为506bp和261bp）鉴别A、B型流感病毒，另根据编码A1和A3型流感病毒糖蛋白HA基因的核苷酸序列设计两对引物，与B型M基因基因引物用同一RT－PCR反应中，可区分A1、A3或B型病毒HA基因和B型病毒M基因又设计了3对引物作为外侧引物，进行巢式－PCR反应。根据第二次PCR的扩增产物在1．2％的琼脂糖凝胶电泳中的大小即可确定型别。经PCR扩增1996－2002年间分离的北京地区A3型流感病毒株HA1区基因，测序并进行序列分析，结果：用上述多重RT－PCR鉴定流感病毒分离株156株，与血凝抑制试验阳性符合率为100％，用多重巢式－PCR检测92份已经病毒分离确定为流感的儿科临床呼吸道标本，与病毒分离和血凝抑制试验阳性符合率分别为76．9％（A1型）、57．1％（A3型）、86．5％（B型），对5株1996－2002年间A3间分离株HA1区基因序列分析结果显示，不同年份的分离株HA1区基因具有较高的核苷酸和氨基酸同源性，而且年份越近的毒株之间同生越测。为流感监测提供更加快速的新方法，北京地区A3型流感毒分离株HA1区基因持续不断地发生点突变，糖基化位点不断增多，可能是导致其抗原漂移的原因。     

拉克罗斯病毒和雪靴野兔病毒双重RT-PCR方法的建立

目的建立针对拉克罗斯病毒(LAC)和雪靴野兔病毒(SSH)的双重RT-PCR检测方法。方法分别针对LAC和SSH病毒的S基因设计2对特异性引物,建立同时检测LAC和SSH的双重RT-PCR方法。以黄病毒属的黄热病毒(YFV)、库京病毒(KUNV)、登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV),布尼亚病毒属的塔希纳病毒(TAHV)和甲病毒属的巴马哈森林病毒(BFV)、玛雅罗病毒(MAYV)、盖塔病毒(GETV)为模板验证方法的特异性,以不同拷贝数的病毒RNA检测该方法的敏感性。结果建立的双重RT-PCR方法能同时扩增到LAC和SSH的目的片段;敏感度分别达到LAC1.41×105copies/μl,SSH 5.6×104copies/μl;与YFV、KUNV、BFV、MAYV无交叉反应。结论建立了双重RT-PCR方法,可用于LAC和SSH病毒的快速检测。     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.