血小板单克隆抗体SZ-51单链抗体的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：探讨降低鼠源性单克隆抗体（单抗）对人体的免疫原性。方法：应用基因工程技术扩增出SZ－51重链和轻链可变区cDNA与连接肽（Gly4Ser）3的寡核苷酸片段进行拼接构建了表达载体pHEN1-51scFv，并导入大肠杆菌HB2151中进行表达。结果：其表达产物可折叠成可溶性并具有抗原结合能力的单链抗体（scFv，小分子肽）释放到细菌培养上清中。结论：该分泌型小肽抗体能特异地与α－颗粒膜蛋白结合，具有与原鼠源单抗一致的抗原结合特性。     

抗人纤维蛋白单克隆抗体SZ－63可变区基因的克隆及其基因工程抗体的研究

应用氯化铯－超离心法从抗人纤维蛋白单克隆抗体ＳＺ一６３杂交瘤细胞抽取总ＲＮＡ，经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素柱层析分离出ｍＲＮＡ。采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，扩增出了ＳＺ－６３重链和轻链可变区基因。应用基因重组技术将ＳＺ－６３可变区基因片段与人免疫球蛋白γ１重链ＣＨ１和轻链恒区基因进行拼接，构建噬菌体ＳＺ－６３／ＨｕＦａｂ表达载体，并在大肠杆菌中表达。表达的嵌合抗体Ｆａｂ片段为可溶性，ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证实能特异地与人纤维蛋白呈结合反应，表达量约为２１０μｇ／Ｌ。     

抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定

目的筛选生物素化三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究相关快速检测试剂盒创造条件。方法本试验利用生物素化三聚氰胺为包被抗原,从半合成噬菌抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体片段。即采用菌噬体表面展示技术,以链亲和素-生物素标记的三聚氰胺为固相包被靶抗原,把靶抗原包被在免疫平板上,加入噬菌体抗体库,则头部带有能与靶抗原特异性结合的抗体分子的噬菌体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉;将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠杆菌,就可以得到含抗体基因的噬菌粒。结果从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程后,获得抗原特异性和结合性较强的生物素化三聚氰胺scFv片段。结论酶联免疫吸附试验等进行鉴定后,筛选得到了抗生物素化三聚氰胺的噬菌体抗体基因片段,为下一步亲和力鉴定、蛋白表达及开发相关检查试剂盒奠定了基础。     

单链抗体表达研究进展

<正>单链抗体(single-chain antibodyfragment,scFv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物,将极大增强对靶细胞的杀伤能力。Kanter等[1研究发     

Mesh词表词汇实用例句：“基因,免疫球蛋白-genes,immunoglobulin”

译文：编码免疫球蛋白轻链和重链的基因，它们分别位于不同染色体上。可变区基因片段V、D、J在淋巴细胞发育中发生重排；恒定区基因C包括决定免疫球蛋白类别和型别的各种基因。为表达免疫球蛋白（即抗体）的基因，它具有表达抗体分子多样性的复杂机制。     

急性淋巴细胞白血病单链抗体(scFv)的筛选与鉴定

目的 筛选急性淋巴细胞白血病病人单链可变区scFv抗体,为进一步表达并得到其特异性强的抗体片段创造条件。方法 实验利用初诊急性淋巴细胞性白血病病人血清为包被抗原,采用噬菌体表面展示技术,从半合成的人源噬菌体抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体,首先把靶抗原包被于免疫平板后,加入噬菌体抗体库,这样能与靶抗原特异性结合的噬菌抗体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉; 将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠埃希菌,就可以得到含特异抗体基因的噬菌粒。结果 经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原特异性较强的白血病病人可变区噬菌体抗体片段并鉴定。结论 获得了一株亲和性较好的抗体片段,为下一步片段表达、鉴定及临床应用研究创造了条件。     

抗CD3抗体（HIT3a）基因突变及其表达研究

目的 提高可溶性抗CD3scFv片段的表达量,并测定其生物学活性。方法 用PCR法致抗CD3scFv基因突变;用DNA限制性酶切指纹图谱以及Western blot法筛选突变克隆;用间接免疫荧光法测定抗体的特异性结合活性;用^125I标记抗体,进行竞争抑制试验;采用^51Cr释放试验,进行抗CD3scFv片段介导的T淋巴细胞细胞毒性测定。结果 DNA序列测定结果表明,抗CD3scFv抗体突变克隆菌株m2为重链第六位氨基酸突变,即E（GAG）→Q(CAG)。突变后的可溶性抗CD3scFv片段表达量（1μg/ml）比突变前（0．01μg/ml）高100 。突变前、后的抗CD3scFv片段与Jurkat细胞（CD3^ ）的结合特异性改变。m2能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a与CD3阳性的Jurkat细胞的结合位点。体外杀伤实验结果显示,由m2与IL－2共刺激产生的CD3AK细胞的细胞毒活性比单用IL－2刺激产生的LAK细胞强。结论 通过对抗CD3scFv抗体基因进行定点突变,实现了该抗体片段的高表达;m2能与CD3^ 的Jurkat细胞结合;也能激活人外周血中的T淋巴细胞产生CD3AK细胞毒活性。     

抗红细胞H抗原单链抗体中可变区重链和轻链顺序对其活性的影响

目的探讨抗红细胞H抗原单链抗体(scFv)中可变区重链(VH)和轻链(VL)顺序对该单链抗体活性的影响。方法采用PCR方法从质粒pMD-18T-2E8scFv(VH-linker-VL型)中克隆出VL和VH可变区基因,通过重叠引物延伸法将这2种基因连接,并引入连接肽(linker)编码序列,构建VL-linker-VH型的单链抗体基因,将VL-linker-VH和原有的VH-linker-VL2种形式的单链抗体基因分别插入到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用镍亲和层析柱纯化;免疫荧光法、竞争ELISA和低离子聚凝胺法检测纯化后scFv活性。结果酶切及测序表明VL-linker-VH型单链抗体表达载体构建成功,SDS-PAGE和Western blot分析表明VL-linker-VH和VH-linker-VL2型抗人红细胞scFv均在BL21菌中获得高效表达,重组蛋白的相对分子质量(Mr)为27kD,表达产物以包涵体形式存在,分别占菌体总蛋白的26.8%和27.6%,纯化后获得了高纯度的scFv;免疫荧光、竞争ELISA和低离子聚凝胺试验分析证明2种单链抗体均可特异结合红细胞表面H抗原,VH-linker-VL结合活性高于VL-linker-VH。结论成功制备了VL-linker-VH型2E8scFv;VH-linker-VL型2E8scFv抗原的纯合活性高于VL-linker-VH型2E8scFv。     

人源化治疗性单克隆抗体的研究进展

治疗性单克隆抗体结合了免疫学和药理学的原理，应用于疾病治疗已有几十年。单克隆抗体在治疗中的运用要特别考虑到生物药效率、耐受性、变化性和适用性。抗体的临床应用结果反映出了单克隆抗体药物存在的一些问题：（1）鼠源性单抗容易产生人抗鼠抗体（HAMA），从而削弱其治疗的有效性：（2）由于鼠单抗是异源蛋白，在体内很快就被清除掉，并对清除抗体的器官产生损害；（3）抗体的分子量相对较大，所以抗体分子到达靶部位不足；（4）鼠源性单抗在人体中常不能有效地活化补体和Fc受体相关的效应功能，因此其应用受到了较大的限制．这些就推动了人源性单抗的产生。     

抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选甲硝唑人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以甲硝唑作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗甲硝唑的90个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与甲硝唑结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选90个克隆中有16株克隆ELISA的490 nm波长吸光度（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清清蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有4株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符,为下一步研究其特异性亲和力的研究创造了条件.     

单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达

本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB／c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码（Gly4Ser），连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv-MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明：分别成功克隆A20细胞的Ig VH和Ig VL基因，并成功制备了scFv片段和scFv-MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法证实，重组pGLo／scFv-MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS-PAGE电泳分析显示，融合蛋白分子量约65kD，与预期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌体蛋白的30％。结论：本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo／scFv-MCP-3，并实现融合蛋白的初步表达。     

从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体

目的从Tomlinson（I＋J）噬菌体抗体库中筛选人源化抗HIV-Tat蛋白单链抗体（scFv）并进行鉴定。方法以HIV-Tat蛋白为抗原,通过＂吸附-洗脱-扩增＂过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗Tat蛋白单链抗体,对其进行基因序列测定,并检测其抗原结合活性。结果经过筛选,获得了1株能与Tat蛋白特异性结合的阳性克隆,经检索kabat数据库,发现其轻、重链可变区分别属于VκⅠ型、VHⅢ型。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Tat蛋白单链抗体。     

克隆IN—l重组单链抗体基因与促进中枢神经再生的研究

目的 利用基因工程技术，对IgMG型的IN-1的基因进行改良，以得到IN-1重组单链抗体（scFv)cDNA基因片段为促使受损的中枢神经再生和治疗弥漫性轴索损伤开辟一个崭新途径。方法 宿主菌为大肠杆菌DH5a，克隆质粒为pUC18。参照genebank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的目的基因片段，将该基因双链分成35个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到经过BamHI和HindⅢ双本科切的克隆载体pUC18中，并转化大肠杆菌DH5a，抽提重组子pUC18/744进行克隆PCR、酶切鉴定及测序分析。结果 测序结果证明获得的基因序列与实验设计仅差一个碱基。结论 正确设计并合成了IN-1重组单链抗体（IN-1-scFv）的cDNA，为深入研究其生物活性奠定了基础，也为应用抗体工程治疗弥漫性轴索损伤开创了一个新思路。     

为诊断和合理治疗新生儿同种免疫性血小板减少症而研制的人类抗体

采用重组技术,通过一种设计和构建方法可研制出人类抗体。作者应用V基因噬菌体显示技术,研制出了一种针对HPA-1a的人类单链可变功能区抗体片段(scFv),这种scFv预防多克隆抗-HPA-1a与血小板结合,阻断了母亲的抗-HPA-1a对胎儿血小板的破坏。为了研制一种有治疗作用的抗体,作者用RhD/抗-D模型设计了一个显性基因,该基因编码一种不能结合经典Fc受体的IgG和Clq。为了完成这个工作,作者以IgG2的脯氨酸/缬氨酸/丙氨酸替换残基233-235,通过IgG4的甘氨酸和丝氨酸/丝氨酸替换残基327和330/331,在IgG支架上应用定向的位点引起突变。用抗-D Fog-1的V基因重组这种变异的稳定区。研制出的这种IgG抗-D抗体不能触发     

血小板单克隆抗体SZ—51单链抗体的基因构建及其在大肠杆菌中？…

探讨降低鼠源性单克隆抗体对人体的免疫原性；方法：应用基因工程技术扩增出ＳＺ－５１重链和轻链可变区ｃＤＮＡ与连接肽的寡核苷酸片段进行拼接构建了表达载体ｐＨＥＮ１－５１ｓｃＦｖ，并导入大肠杆菌ＨＢ２１５１中进行表达。结果：其表达产物可折叠成可溶性并具有抗原结合能力的单链抗体释放到细菌培养上清中。结论：该分泌型小肽抗体能特异地与α－颗粒膜蛋白结合具有原鼠源单抗一致的抗原结合特性。     

慢性自发性荨麻疹抗IgE高亲和力受体自身抗体检测方法研究

目的通过噬菌体展示技术制备人FcεRIα的scFv片段并建立抗人FcεRIα自身抗体的检测方法,为慢性自发性荨麻疹的临床治疗提供有效的诊断依据。方法通过噬菌体抗体库筛选技术,筛选得到携带目标scFv片段的噬菌体并进行富集;通过测序分析确定阳性克隆,并将其进行大量表达和纯化;利用scFv片段构建抗人FcεRIα自身抗体的检测方法。结果通过噬菌体展示技术筛选富集得到12个与抗人FcεRIα抗体结合的噬菌体阳性克隆;经测序分析及酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定后选择A20转化到表达菌株中大量表达;利用表达获得的scFv片段构建抗人FcεRIα自身抗体的检测方法并采用受试者工作特征(ROC)曲线分析,确定该方法的临界(cut off)值为0.635,其灵敏度及特异度分别为96.7%和100.0%。结论成功构建人血清中抗人FcεRIα自身抗体的检测方法,为后续临床研究提供了有利的理论基础。     

抗环胍氨酸肽单链噬菌体抗体库的建立

【目的】拟构建并鉴定抗环胍氨酸肽（cyclic citrutlinated peptide,CCP）单链片段V（Single chain Fragment V,ScFv）噬菌体抗体库,为进一步可溶性表达和检测类风湿性关节炎（RA）关节滑膜的CCP表达情况,揭示CCP及其抗体在RA发病中作用奠定基础。【方法】①分离抗CCP抗体阳性患者外周血单个核细胞,提取mRNA并反转录cDNA。扩增免疫球蛋白重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）。通过重叠聚合酶链反应（PCR）用连接片段将VH和Vκ／Vλ体外连接成单链抗体基因;SfiⅠ和NotⅠ酶切并与噬菌粒PHEN2连接;将pHEN2ScFv电转至感受态大肠杆菌TG1,建立抗CCp-ScFv噬茵体抗体库;②检测抗CCP-ScFvPHEN2噬菌体的库容、插入效率;【结果】抗CCP-ScFv噬菌体抗体库库容8．76×10^8CFUcfu／mL,插入频率83．3％;插入率83．33％。所插入DNA片断约1180bp。MSPⅠ酶切指纹图谱鉴定也显示多样性。【结论】所构建抗环胍氨酸肽单链噬茵体抗体库库容可满足进一步可溶性表达的要求。     

抗人纤维蛋白单克隆抗体SZ—63可变区基因的克隆及其基因工…

应用氯化铯－超离心法从抗人纤维蛋白单克隆抗体ＳＺ－６３杂交瘤细胞抽取总ＲＮＡ，经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素柱层析分离出ｍＲＮＡ。采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，扩增出了ＳＺ－６３重链和轻链可变区基因。     

Ⅱ型变态反应发生的机理是什么？

答：Ⅱ型变态反应是由体内存在的天然血型抗原，或由外来抗原、半抗原和自身组织细胞表面抗原刺激机体产生的抗体，与相应靶细胞表面抗原作用后引起的。参与反应的抗体多属IgG，少数为IgM，当抗体与靶细胞本身的表面抗原或与靶细胞表面吸附的抗原、半抗原结合，或抗原与抗体以免疫复合物的形式吸附于靶细胞表面后，通过三个不同的作用途径损伤破坏靶细胞：（1）激活补体系统，使靶细胞溶解；（2）通过免疫调理被吞噬细胞吞噬溶解破坏；（3）通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用使靶细胞溶解破坏。     

抗人纤维蛋白单抗SZ—63嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达研究

目的：减少鼠源性单抗的免疫原性，获得最接近于天然构型的高表达基因工程抗体。方法：将抗人纤维蛋白单抗SZ－63的轻链可变区基因VK和重链可变区基因VH分别与人IgG恒区基因CK、CH进行拼接、扩增，构建了真核表达载体α－lys17－63VK／Hu和α－lys30－63VH／Hu，并应用linofectin方法将其相继导入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，通过加压筛选获得一抗性细胞克隆，经体外长期传代培养和三次克隆化得到一稳定表达的阳性细胞株。结果：培养上清液中的抗体蛋白表达量为1mg／L，腹水中为40mg／L经Westernblot和竞争实验证实表达的嵌合抗体具有与亲本鼠源单抗相一致的纤维蛋白结合特性。结论：SZ－63嵌合抗体可用于血栓性疾病的导向显像和治疗。