TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法：采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达。用SDS－PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA 柱层析纯化后,得到纯度为90％的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting。结果：经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株。结论：该蛋白具有良好的抗原活性。     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的 :用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原 ,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法 :采用PCR方法扩增TTVORF2 基因 ,将之插入到测序质粒载体中进行测序 ,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30 ,并转化大肠杆菌M15菌株 ,进行诱导表达。用SDS PAGE分析表达产物。表达产物经Ni NTA柱层析纯化后 ,得到纯度为90 %的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western BlotBlotting分析。结果 :经IPTG诱导后 ,筛选出 2株高表达株。结论 :该蛋白具有良好的抗原活性     

河南TT病毒全基因序列测定及TTV感染检测方法的研究

目的 :为了分析河南省TTV的基因结构、特征及基因变异 ,建立适合我国人群的诊断方法。方法 :采用巢式聚合酶链式反应 (PCR)技术从河南省血液中心献血员TTV阳性血清中扩增TTV全基因 ;用PCR方法扩增ORF2片段 ,进行原核表达 ,并转化大肠杆菌 ,进行诱导表达。用SDS PAGE分析表达产物。结果 :在国内较早地克隆测定了一株TTV河南分离株的基因序列 ;建立了检测TTV感染的PCR检测方法 ;在国内较早地表达出TTV重组蛋白抗原 ,抗原具有良好的活性。结论 :用表达的抗原初步建立了检测血清抗 TTVIgG抗体的间接ELISA方法 ,可有效地应用于TTV感染的检测。     

人微小病毒B19 VP2蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：利用原核系统表达人微小病毒B19的重组蛋白抗原,为建立ELISA方法诊断B19病毒感染提供特异性抗原。方法：采用PCR方法扩增B19 VP2基因,将之插入到T载体中进行测序,验证序列正确后再重组入原核表达载体pET-30a( ),并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达。用SDS-PAGE分析表达产物。表达产物经亲合层析柱纯化得到VP2重组蛋白抗原。用B19 VP2 IgG对该蛋白进行了Western-Blot分析。结果：筛选出2株B19 VP2蛋白抗原高表达菌株,经IPTG诱导后,表达VP2重组蛋白量占菌体总蛋白量的24．6％。结论：VP2重组蛋白具有良好的抗原活性。     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的:表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白),并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体(mAb).方法:采用RT PCR方法,从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因.测序确认后,再亚克隆至原核表达载体中.从SDS PAGE凝胶中 回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果:从标本中扩增出1269bp的DNA,测序结果证实 为N蛋白基因.将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了较好的表达.表达产物经SDS PAGE后,在Mr约为 43000处可见1条明显的诱导表达带.Westernblot的结果表明,该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应.从 SDS PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠,制备出3株抗N蛋白的mAb.这些mAb与SDS PAGE凝胶上Mr约为 43000的蛋白带也呈现很强的免疫反应.结论:所获的重组N蛋白及特异性mAb,将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的 方法奠定了基础.     

转录因子Oct-4基因的克隆和原核表达

目的克隆转录因子Oct-4基因、构建原核表达载体。方法从人胚胎标本中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Oct-4基因的cDNA,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,纯化后SDS-PAGE分析表达产物。结果电泳证实RT-PCR扩增产物与预期长度一致,测序结果与GenBank公布的Oct-4基因序列一致较好,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量47KD左右出现目的蛋白表达条带。结论成功构建了pET-Oct-4原核表达载体,表达并纯化出Oct-4蛋白,为进一步研究Oct-4蛋白打下了实验基础。     

卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXR1、OV-189原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXRl、OV-189的原核表达载体.方法:用PCR从含SEREX抗原基因序列的重组pBK-CMV质粒中扩增FXRl、OV-189的CDS,双酶切后插入原核表达质粒pET-30b( ),经酶切及测序鉴定,阳性质粒转化表达菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:成功扩增了FXRl、OV-189的CDS,并构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,经测序,与Genbank中的相应序列一致,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达目的蛋白.结论:成功构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,并在大肠杆菌中表达了重组融合目的蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum-5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中,转化感受态细胞DHSα,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pQE-30-Tum-5,表达的蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum-5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.